[摘要]目的：探討化州柚栽培品種間的質(zhì)量差異，為尋找良種提供科學(xué)依據(jù)。 方法：采用HPLC建立化州市綠色生命有限公司GAP基地不同栽培品種毛橘紅藥材指紋圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì) “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版”軟件進(jìn)行相似度分析及品種判定。結(jié)果：不同栽培品種樣品指紋圖譜整體特征相似，18個(gè)共有峰峰面積相似度在0.938～0.998，利用相似度軟件判定栽培品種成功率為92%。結(jié)論：應(yīng)用該法可較好地判別毛橘紅藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣及品種來源，并可為化州柚良種尋找提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。
　　[關(guān)鍵詞]毛橘紅；指紋圖譜；不同栽培品種；質(zhì)量控制；種質(zhì)資源
　　祛痰鎮(zhèn)咳常用中藥化橘紅基源為化州柚Citrus grandis ‘Tomentosa’和柚C. grandis。《本草原始》云：橘紅，廣東化州者勝。自古以來，化橘紅均以化州市特有樹種——化州柚未成熟外層果皮入藥，其外果皮密被絨毛，習(xí)稱毛橘紅[1]。化州柚是柚的栽培變種，經(jīng)于化州市特定環(huán)境的長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁衍，其樹形、樹葉、果實(shí)等原植物外形發(fā)生了一定程度的分化，當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)根據(jù)其原植物外形分化，提出黃絨果、假西洋、金錢肚、鳳尾、陸福等化州柚藥材品種[2]。
　　課題組研究發(fā)現(xiàn)，毛橘紅與光橘紅在黃酮類成分、揮發(fā)油成分等均有明顯的差異[3]，利用信息熵的方法可快速識(shí)別毛橘紅與光橘紅[4]；不同栽培品種的化州柚藥材總黃酮和柚皮苷的含量均不相同，大茶嶺和鳳尾2品種藥材含量均明顯高于其他栽培品種[2]。為了進(jìn)一步探討化州柚栽培品種間的質(zhì)量差異，為尋找良種提供科學(xué)依據(jù)，作者進(jìn)行本項(xiàng)研究。
　　1材料
　　試驗(yàn)所用毛橘紅藥材樣品均采自化州市綠色生命有限公司化橘紅GAP基地，經(jīng)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)林勵(lì)研究員鑒定，其基源為化州柚C. grandis ‘Tomentosa’。柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素（均為自制，采用峰面積歸一化法計(jì)算，純度分別為98.21%，99.32%，98.68%），芹菜素（北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，批號(hào)520-36-5）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司，批號(hào)603-001-00-X），冰乙酸（優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐，批號(hào)20090919）；其余所用試劑均為分析純。
　　Waters 2965 HPLC系統(tǒng) （Waters Corporation， Milford， MA， USA）：四元泵，在線真空脫氣系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，DAD檢測(cè)器，Empower3工作站。
　　2方法
　　2.1色譜條件Waters Symmetry C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）。流動(dòng)相為A（甲醇）-B（2%醋酸溶液），采用梯度洗脫：0～8 min，0～10%A；8～12 min，10%～12% A；12～15 min， 12%～13% A；15～25 min， 13%～25% A；25～60 min， 25%～55% A；60～65 min，55%～62% A；65～68 min，62%～70% A。流速1.0 mL·min^-1 ，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；柱溫箱（35±5） ℃；進(jìn)樣量10 μL。
　　2.2對(duì)照品溶液的制備取柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素、芹菜素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為20，0.3，1.5，0.04 g·L^-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。
　　2.3檢測(cè)波長(zhǎng)考察采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，分別提取在283，310，330，345 nm波長(zhǎng)處的色譜圖，以柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素、芹菜素為對(duì)照品，結(jié)果在330 nm下色譜峰峰數(shù)多，基線比較平穩(wěn)，色譜信息最為豐富，因此選擇該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
　　2.4供試品提取按照文獻(xiàn)[5]方法，精密稱定干燥至恒重的樣品粉末（過4號(hào)篩）0.2 g，每個(gè)樣品平行做3份，置具塞錐形瓶中，加石油醚20 mL，超聲提�。�500 W，40 kHz）30 min，棄去石油醚液，待樣品中殘存的石油醚全部揮去后，加甲醇20 mL，密塞，精密稱定，超聲提取30 min，取出，放涼，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，并用甲醇洗滌濾器和濾渣數(shù)次，濾液全部轉(zhuǎn)移到100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，取適量用0.45 μm濾膜過濾，即得。
　　2.5測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。
　　3結(jié)果
　　3.1精密度考察精密吸取毛橘紅樣品（37號(hào)）溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察色譜峰保留時(shí)間的一致性，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積基本一致，在同一儀器測(cè)得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似度大于0.99（中位數(shù)），符合指紋圖譜的要求。
　　3.2重復(fù)性考察取同樣批號(hào)的樣品5份，同上操作，考察色譜峰保留時(shí)間的一致性，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積基本一致，在同一儀器測(cè)得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似度大于0.99（中位數(shù)），符合指紋圖譜的要求。
　　3.3穩(wěn)定性考察精密吸取毛橘紅樣品（37號(hào)）溶液10 μL，分別在1，8，16，24，48 h連續(xù)測(cè)定5次，以選定的柚皮苷色譜峰為觀測(cè)指標(biāo)，考察色譜峰保留時(shí)間的一致性，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積基本一致，在同一儀器測(cè)得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似度大于0.99（中位數(shù)），表明在48 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。
　　3.4毛橘紅藥材HPLC指紋圖譜中的特征峰采集50批毛橘紅藥材的HPLC指紋圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件（以下簡(jiǎn)稱相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版），生成毛橘紅藥材共有模式的對(duì)照指紋圖譜，見圖2，其中共有色譜峰18個(gè)，9～11，14號(hào)峰分別為柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素、芹菜素的色譜峰。為便于辨認(rèn)和分析，將共有色譜圖分成3個(gè)區(qū)，Ⅰ區(qū)包括1～8號(hào)峰（tR 9.7～30.8 min），Ⅱ區(qū)包括9～11號(hào)峰（包括柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素峰，tR 30.8～40.8 min），Ⅲ區(qū)包括12～18號(hào)峰（包括芹菜素峰，tR 40.8～62.6 min）。

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