[摘要] 目的：研究不同種源地廣金錢草藥材質(zhì)量變異及遺傳多樣性，為合理利用廣金錢草種質(zhì)資源及優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。方法： 采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對18個種源地廣金錢草進(jìn)行遺傳多樣性分析，用NTSYSpc2.11F軟件計(jì)算并分析廣金錢草種質(zhì)間的相似度，構(gòu)建遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用HPLC測定藥材夏佛塔苷含量，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果：通過篩選得到8對AFLP引物組合，共擴(kuò)增出844個DNA條帶，多態(tài)性條帶為717個，多態(tài)性位點(diǎn)平均為84.27%；通過聚類分析，將18個種源地的廣金錢草種質(zhì)分為3大類。種源間廣金錢草藥材夏佛塔苷含量差異顯著，海南三亞種源夏佛塔苷含量顯著高于其他種源地藥材夏佛塔苷含量。結(jié)論：不同種源廣金錢草藥材質(zhì)量差異顯著，遺傳多樣性豐富，蘊(yùn)藏著優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，可以進(jìn)行綜合開發(fā)及優(yōu)良品種選育。
　　[關(guān)鍵詞] 廣金錢草；質(zhì)量變異；遺傳多樣性
　　[稿件編號] 20120917016
　　[基金項(xiàng)目] 國家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2007FY110600）；中山市科技局華南現(xiàn)代中醫(yī)藥城項(xiàng)目（20101H020）
　　[通信作者] *楊全，Tel： （020）39352327，Email： yangquan7208@vip.163.com
　　廣金錢草為豆科植物廣金錢草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分。具有利濕退黃，利尿通淋的功效[1]，廣金錢草主要含有黃酮、生物堿、酚類、揮發(fā)油等化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究表明本品具有抗泌尿系統(tǒng)結(jié)石、改善心血管系統(tǒng)、抗炎和利膽的作用。也是中成藥“消石飲”、“消炎利膽片”、“消石片”和“金錢草沖劑”中成藥的主要原料之一[2]。近年來，不少專家學(xué)者對廣金錢草的研究主要集中在栽培技術(shù)[3]、藥理[4]、化學(xué)成分[5]等方面，有關(guān)廣金錢草遺傳多樣性和不同種源地有效成分含量差異方面未見報道，課題組在進(jìn)行廣金錢草資源調(diào)查的過程中，采集了不同種源地PCR樣品和有效成分分析樣品，從有效成分含量差異和遺傳學(xué)的角度探討藥材質(zhì)量變異和遺傳變異。
　　擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）是一種有效的物種遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記方法[6]。由于其具有快速、靈敏、穩(wěn)定、所需DNA 量少、多態(tài)性豐富和重復(fù)性好等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于人參[7]、黃芩[8]、天麻[9]、夏枯草[10]等植物的遺傳多樣性研究。本文采用AFLP技術(shù)，研究不同種源地的廣金錢草在分子水平上的遺傳變異，采用HPLC分析廣金錢草質(zhì)量變異情況，為今后開展種源選擇、種質(zhì)鑒定、優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。
　　1 材料與方法
　　1.1 廣金錢草
　　廣金錢草為2008年7—8月分別在廣東、廣西、海南采集的野生樣品，每個種源取3株廣金錢草成熟、無病蟲害的健康葉片，混合后作為1個樣品，將新鮮葉片置裝有變色硅膠的封口袋內(nèi)，迅速干燥，備用；每個種源地采集3份廣金錢草，干燥后作為有效成分分析樣品備用。種源地及樣品編號見表1。
　　1.2 儀器與試劑
　　高效液相色譜儀（Waters 2695型，USA），二極管陣列檢測器（Waters 2996型，USA），數(shù)控超聲波清洗器（KQ500DE型，中國昆山），色譜柱（C18，4.6 mm×250 mm，5 μm， phenomenexLuna），PCR擴(kuò)增儀（9600型，Perkin Elmer， USA），低溫冷凍離心機(jī)（3K18型，Sigma ，USA），測序儀 （377型，USA ），核酸蛋白檢測儀（Biorad，USA），電泳儀（DG3D型，北京鼎國）。
　　內(nèi)切酶、引物、T4 連接酶（北京鼎國），丙稀酰胺、尿素、甲酰胺、甲叉丙稀雙酰胺（Sigma）。
　　表1 野生廣金錢草種質(zhì)資源信息
　　Table 1 Samples of the wild Desmodium styracifolium germplasm resources
　　1.3 夏佛塔苷含量測定
　　參照《中國藥典》[1]（2010年版一部）廣金錢草項(xiàng)下的含量測定方法。流動相甲醇水（32∶68）；流速0.8 mL·min-1；柱溫 35 ℃；檢測波長 272 nm；進(jìn)樣量 10 μL。回歸方程為Y=19 324X-1.315 1，r=1.000 0（n=6）；線性范圍0.219～7.841 μg ，r=1.000 0（n=6）。精密度RSD 0.15%（n=6）；重復(fù)性RSD 3.7%（n=6）；樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD 0.2%（n=6）；加樣回收率RSD 1.7%。以夏佛塔苷作為對照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算百分含量。
　　1.4 AFLP分析
　　1.4.1 總DNA提取 采用CTAB法[11]進(jìn)行基因組總DNA的提取，用UItrospc 2000 紫外可見分光光度計(jì)檢測DNA的純度及濃度。
　　1.4.2 接頭和引物 從64對AFLP引物中篩選出8對帶型分布均勻、多態(tài)性高且分辨力強(qiáng)的引物進(jìn)行AFLP分析，見表2。
　　1.4.3 酶切與連接 本實(shí)驗(yàn)參照鼎國生物技術(shù)公司AFLP試劑盒說明書進(jìn)行。首先采用NEB （New England BioLabs）公司提供的2種限制性內(nèi)切酶Pst I和Mse I對基因組總DNA進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶，將Pst I和Mse I接頭與酶切片斷連接起來，酶切連接一步完成，酶切連接體系20 μL：總DNA 4 μL（50 mg·L-1）；Adapter 1 μL；Pst I/Mse I 2 μL；10×Reaction buffer 2.5 μL；10 mmol·L-1 ATP 2.5 μL；T4 Ligase 1 μL；ddH2O 7 μL。混勻離心數(shù)秒，37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過夜。

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