基于ITS2和?psbA—trnH?序列對(duì)細(xì)小種子類藥材車前子的鑒定比較
發(fā)布時(shí)間:2019-08-28 來源: 歷史回眸 點(diǎn)擊:
[摘要]為考察ITS2 序列和psbA-trnH 序列對(duì)車前子藥材及其常見混偽品的鑒定能力,該研究對(duì)車前子2個(gè)基原物種及7種混偽品共71份樣本進(jìn)行了研究。采用MEGA 5.1對(duì)獲得的ITS2和psbA-trnH進(jìn)行序列比對(duì),計(jì)算種內(nèi)和種間kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示,車前和平車前的ITS2 序列長(zhǎng)度分別為199,200 bp;兩者的ITS2序列種內(nèi)最大 K2P 遺傳距離均小于與混偽品的最小種間K2P 遺傳距離;基于ITS2 序列構(gòu)建的NJ 樹中,車前、平車前及其混偽品都表現(xiàn)出良好單系性,都能相互明顯區(qū)分。表明ITS2序列能將車前子藥材與混偽品進(jìn)行很好的區(qū)分。車前和平車前的psbA-trnH序列長(zhǎng)度均為340 bp,兩者的psbA-trnH 序列種內(nèi)最大K2P 遺傳距離小于與混偽品的最小種間K2P 遺傳距離;基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 樹結(jié)果顯示,除大車前外,車前子藥材與其余混偽品可以明顯區(qū)分。因此,ITS2序列作為DNA條形碼,車前子及其混偽品具有良好的鑒別能力,對(duì)保障車前子用藥安全具有重要意義。
[關(guān)鍵詞]車前子;混偽品;DNA 條形碼;ITS2 ;psbA-trnH
車前子為車前科植物車前Plantago asiatica L. 或平車前P. depressa Willd. 的干燥成熟種子,具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰等功效[1]。車前子為常用中藥材,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列為上品。目前,車前子的鑒別多從外觀性狀、顯微鑒別和理化等方面進(jìn)行研究[2-4]。車前子常見的混偽品有大車前、長(zhǎng)葉車前、葶藶子、青葙子、菟絲子等[4]。由于車前子及其混偽品都屬于極細(xì)種子類藥材,從外觀形態(tài)上很難將其進(jìn)行區(qū)分,傳統(tǒng)的鑒定方法已經(jīng)無法滿足目前的要求,急需一種快速準(zhǔn)確的鑒定方法,以確保臨床用藥安全。
DNA 條形碼技術(shù)是當(dāng)今生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)和方向。該技術(shù)簡(jiǎn)便高效,不受樣品的形態(tài)限制,能對(duì)中藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[5-7]。國(guó)家藥典委員會(huì)于2012年討論并通過在《中國(guó)藥典》(2010年版)增補(bǔ)本中列入《中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》,該指導(dǎo)原則通過對(duì)大樣本量中藥材進(jìn)行DNA 條形碼分子鑒定研究,建立以ITS2序列為核心、psbA-trnH 序列為輔的植物類藥材DNA 條形碼鑒定體系[8]。
本研究以車前子藥材及其常見混偽品作為研究對(duì)象,驗(yàn)證ITS2 序列以及psbA-trnH 序列作為DNA 條形碼對(duì)車前子藥材及其混偽品鑒定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,保障車前子用藥安全。
1 材料
本研究共收集71份樣本,其中車前子藥材共39份(車前32份,平車前7份),車前子基原植物樣本共9份(車前5份,平車前4份),混偽品7個(gè)物種共32份樣本,樣品來源見表1。樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定,憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。
2 方法
2.1 DNA提取 取藥材或硅膠干燥的葉片約40 mg,用高通量組織研磨儀(Sceintz-48,寧波新芝)研磨2 min (30次/min),使用植物基因組DNA 提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取總DNA。
在提取過程中,樣品研磨后加入700 μL 核分離緩沖液抽提3次,加入細(xì)胞裂解液56 ℃水浴8~9 h。其余步驟按DNA 提取試劑盒操作說明進(jìn)行。
2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 ITS2序列和psbA-trnH序列PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件參見《中藥DNA條形碼分子鑒定》[9],PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)并純化后,使用ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.,USA)測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。
2.3 數(shù)據(jù)處理 獲得的測(cè)序峰圖采用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCode Co.,USA)校對(duì)拼接,去除引物區(qū)及低質(zhì)量區(qū)。使用隱馬爾可夫模型HMMer序列注釋方法[10]去除兩端5.8S和28S區(qū)段,獲得ITS2 序列。通過與GenBank序列進(jìn)行Blastn比對(duì),通過參考序列進(jìn)行注釋,獲得psbA-trnH 序列。用軟件MEGA 5.1進(jìn)行序列比對(duì)[11],基于Kimura-2-parameter (K2P)模型計(jì)算遺傳距離,并用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。
3 結(jié)果與分析
3.1 車前子藥材DNA提取及PCR擴(kuò)增效率 由于車前子中含大量黏液質(zhì)(多糖類化合物)[12-14] ,按照常規(guī)方法提取車前子DNA,提取效率較低。本文在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過改進(jìn)DNA提取方法,可以成功提取所有樣品DNA,其PCR產(chǎn)物電泳后均可顯示出單一目的條帶,ITS2序列和psbA-trnH序列的擴(kuò)增效率均可達(dá)到100%。經(jīng)雙向測(cè)序后,能得到高質(zhì)量的ITS2序列和psbA-trnH序列。
3.2 車前子藥材及其混偽品ITS2序列特征 車前和平車前ITS2序列長(zhǎng)度分別為199,200 bp,G+C含量分別為54.7%,52.9%。來自于北京、重慶、浙江杭州等15個(gè)產(chǎn)地的36條車前ITS2序列種內(nèi)無任何變異位點(diǎn),序列相似性100%;來自于北京、吉林長(zhǎng)白山、河北涿州等5個(gè)產(chǎn)地的12條平車前ITS2序列僅1個(gè)變異位點(diǎn),可分為2個(gè)單倍型(表1),其中單倍型B1共10條序列,單倍型B2共2條序列,見表2。與平車前12條ITS2序列比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)36條車前序列在33 bp處有一個(gè)穩(wěn)定的堿基缺失。
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