[摘要]為提高當(dāng)歸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，解決部分對(duì)照品稀缺問(wèn)題，進(jìn)行了以對(duì)照提取物為對(duì)照的當(dāng)歸藥材質(zhì)量控制研究。采用色譜分離技術(shù)制備對(duì)照提取物，并對(duì)其中3個(gè)指標(biāo)成分阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H進(jìn)行標(biāo)定，建立了以對(duì)照提取物為對(duì)照的當(dāng)歸藥材UPLC含量測(cè)定方法，并采用t檢驗(yàn)對(duì)以對(duì)照提取物和對(duì)照品為對(duì)照的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果基本一致，該方法可用于當(dāng)歸藥材質(zhì)量控制，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，本研究初步驗(yàn)證了其可行性。
　　[關(guān)鍵詞]當(dāng)歸；對(duì)照提取物；質(zhì)量控制
　　中藥材中活性成分的含量是決定其質(zhì)量?jī)?yōu)劣、有效性和安全性的主要因素，因此成分的定量分析是中藥材質(zhì)量控制的關(guān)鍵。同時(shí)中藥的復(fù)雜性決定了以單一成分為指標(biāo)難以全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量，多成分含量測(cè)定逐漸成為中藥質(zhì)量控制的趨勢(shì)。然而這種質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，卻受到中藥化學(xué)對(duì)照品分離難度大、單體不穩(wěn)定或供應(yīng)價(jià)格高等因素的制約^[1]，限制了其在中藥生產(chǎn)企業(yè)的推廣應(yīng)用^[2]，導(dǎo)致中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的步伐遲緩�！耙粶y(cè)多評(píng)”的含量測(cè)定方法在一定程度上解決了中藥對(duì)照品缺失、價(jià)格昂貴及不穩(wěn)定的問(wèn)題，現(xiàn)已在丹參、黃連、金銀花等多種藥材的多成分定量分析和多指標(biāo)質(zhì)量控制中得到應(yīng)用3-5，但此法在相對(duì)校正因子的定量、指標(biāo)成分的色譜峰定性，尤其是方法的實(shí)用性和耐用性方面尚存在一些問(wèn)題^[6]。開(kāi)發(fā)中藥對(duì)照提取物可能成為有效措施之一^[7]，對(duì)照提取物為中藥的“標(biāo)準(zhǔn)”提取物，其組分比例相對(duì)固定，且指標(biāo)性成分含量已經(jīng)采用相應(yīng)的對(duì)照品進(jìn)行標(biāo)定，可配制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于中藥材多成分分析^[8]，尤其適用于組分明確但單體對(duì)照品不易獲得的成分測(cè)定。目前以對(duì)照提取物為對(duì)照的含量測(cè)定方法仍處于起步和探索階段，關(guān)于其用于中藥質(zhì)量控制的適用性和可行性報(bào)道較少。
　　當(dāng)歸是中醫(yī)臨床常用藥材，為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis （Oliv.）Diels的干燥根。目前，關(guān)于當(dāng)歸質(zhì)量控制方法的研究很多，定性方面以薄層色譜鑒別和指紋圖譜研究為主，含量測(cè)定方面主要是以單成分阿魏酸為指標(biāo)，阿魏酸普遍存在于多種中藥材中，專屬性較差，僅以其為指標(biāo)不能全面地評(píng)價(jià)當(dāng)歸藥材質(zhì)量^[9-11]。同時(shí)當(dāng)歸中的一些活性成分如藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞等的穩(wěn)定性差，在實(shí)際應(yīng)用中難以作為質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行藥材的質(zhì)量控制^[12-13]。本實(shí)驗(yàn)制備對(duì)照提取物操作簡(jiǎn)便且成本較低，可在兩類成分上控制當(dāng)歸藥材質(zhì)量，同時(shí)解決了洋川芎內(nèi)酯I及洋川芎內(nèi)酯H對(duì)照品缺乏、價(jià)格昂貴等問(wèn)題，建立了以對(duì)照提取物為對(duì)照的當(dāng)歸藥材多成分含量測(cè)定方法，為其更為全面、專屬性更好的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。
　　1 儀器與試藥
　　Reveleris X2全息快速純化色譜系統(tǒng)（GRACE公司）；ACQUITY UPLC系統(tǒng)（二元高壓泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測(cè)器，Waters公司）；MF-MS105電子分析天平（METTLER TOLEDO公司）；EPED-E2-30TF超純水系統(tǒng)（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；KH -300型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。
　　對(duì)照提取物自制；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-201012，供含量測(cè)定用），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；洋川芎內(nèi)酯I（批號(hào)130601，供含量測(cè)定用）、洋川芎內(nèi)酯H（批號(hào)130816，供含量測(cè)定用），均購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司；當(dāng)歸藥材信息見(jiàn)表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定，均為傘形科植物當(dāng)歸A. sinensis的干燥根。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 對(duì)照提取物的制備
　　甘肅岷縣當(dāng)歸藥材，切片，8倍量70%乙醇浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓回收溶劑濃縮成稠膏。將稠膏與硅膠1∶1均勻拌樣，于80 ℃真空干燥，以含樣硅膠與空白硅膠1∶12干法上樣，用Reveleris X2中壓制備系統(tǒng)快速去除藁本內(nèi)酯等極性小的成分，收集阿魏酸（1）、洋川芎內(nèi)酯H（2）、洋川芎內(nèi)酯I（3）部位，洗脫條件見(jiàn)表2，制備色譜圖見(jiàn)圖1。將收集得到的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I部位回收溶劑，得淺黃色油狀物。用適量甲醇溶解，使阿魏酸的質(zhì)量濃度2.5～3.0 g·L^-1，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，將濾液封裝于安瓿瓶中，即得所需的對(duì)照提取物。
　　2.2 對(duì)照提取物的標(biāo)定
　　2.2.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取阿魏酸對(duì)照品28.50 mg、洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品10.70 mg、洋川芎內(nèi)酯H對(duì)照品2.06 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，配制成含阿魏酸114 mg·L^-1、洋川芎內(nèi)酯I 42.8 mg·L^-1、洋川芎內(nèi)酯H 8.24 mg·L^-1的混合對(duì)照品溶液，再用70%甲醇逐級(jí)稀釋成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液（濃度分別為阿魏酸：114，57.0，28.5，14.2，7.12，3.56 mg·L^-1；洋川芎內(nèi)酯I：42.8，21.4，10.7，5.35，2.68，1.34 mg·L^-1；洋川芎內(nèi)酯H：8.24，4.12，2.06，1.03，0.515，0.258 mg·L^-1）。
　　2.2.2 供試品溶液配制 精密吸取自制對(duì)照提取物1 mL，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇定容，即得。
　　2.2.3 色譜條件 利用混合對(duì)照品建立工作曲線，見(jiàn)表3，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，色譜條件如下：ACQUITY UPLCR BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫[ 0～3 min，A-B （15∶85～35∶65）；3～4 min，A-B （35∶65～37∶63）；4～5 min，A-B （37∶63～37∶63）；5～8 min，A-B（37∶63～45∶55）；8～9 min，A-B（45∶55 ～15∶85）]；流速0.3 mL·min^-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量5 μL；以阿魏酸計(jì)理論塔板數(shù)不低于8萬(wàn)。在該色譜條件下，3個(gè)成分與相鄰組分達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5。3批對(duì)照提取物含量標(biāo)定結(jié)果，見(jiàn)表4，混合對(duì)照品、對(duì)照提取物及藥材的UPLC圖，見(jiàn)圖2。

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