[摘要]為優(yōu)化獲得一種準(zhǔn)確、快速、高效鑒別藥典所載蛇類藥材（烏梢蛇，金錢白花蛇，蘄蛇）真?zhèn)纹返姆椒�。該研究以蛇類藥材�?jīng)典PCR鑒定方法為基礎(chǔ)，采用堿裂解法提取基因組總DNA，加入特異性PCR引物，采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而對(duì)蛇類藥材及其混淆品進(jìn)行鑒別。通過對(duì)影響PCR反應(yīng)時(shí)間的退火溫度、變性溫度、退火時(shí)間、變性時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等因素進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)不同型號(hào)PCR儀和Taq酶進(jìn)行考察，分別獲得烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇快速PCR反應(yīng)程序。在PCR產(chǎn)物中加入SYBR Green I染料，正品顯示出明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。所建立的蛇類藥材快速PCR真?zhèn)螜z測(cè)方法可在30～45 min完成，為蛇類藥材現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定提供技術(shù)支持。
　　[關(guān)鍵詞]快速PCR；蛇類中藥材；分子鑒定；熒光檢測(cè)
　　蛇類藥材一直是動(dòng)物藥重要的組成部分，多具祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙功效，臨床應(yīng)用較為廣泛�！吨袊�(guó)藥典》2010年版中共收載了3種蛇類藥材：烏梢蛇Zaocysd humnades，金錢白花蛇Bungarus multicinctus，蘄蛇Agkistrodon acutus。近年來(lái)，由于野生資源逐漸匱乏，加上價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上出現(xiàn)蛇類偽品和混淆品甚多，且僅憑外部形態(tài)特征難以準(zhǔn)確辨認(rèn)^[1]。隨著分子鑒定技術(shù)的引入，藥典鑒別項(xiàng)下增加了烏梢蛇、蘄蛇的PCR鑒定，但由于藥典所載方法用時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法適應(yīng)當(dāng)前中藥分子鑒定技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用的需要^[2]。
　　PCR作為分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，隨著研究和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷增長(zhǎng)，存在著相當(dāng)巨大的改進(jìn)空間。自Millus等^[3]發(fā)明PCR技術(shù)以來(lái)，對(duì)PCR技術(shù)的改良從未停止過。Yap等^[4]通過調(diào)整PCR條件來(lái)縮短PCR反應(yīng)時(shí)間。Wittwer等^[5-6]通過熱空氣注入法快速控溫，從而減少升降溫的時(shí)間，并提出了快速PCR（rapid PCR）的概念。
　　快速、準(zhǔn)確、高通量鑒別是現(xiàn)代中藥分子鑒別的核心需要，本文基于烏梢蛇、蘄蛇藥典PCR鑒定方法和已建立的金錢白花蛇PCR鑒定方法^[7]，對(duì)這3種蛇類藥材PCR鑒別技術(shù)的反應(yīng)程序進(jìn)行了優(yōu)化，建立了快速PCR鑒別方法，并引入了熒光染料法對(duì)真?zhèn)舞b別結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合藥材DNA快速提取技術(shù)^[8]，可將蛇類藥材真?zhèn)舞b別時(shí)間控制在30 min左右，為實(shí)現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用提供技術(shù)支撐。
　　1 材料
　　1.1 蛇類藥材 選取來(lái)自于不同產(chǎn)地的11批烏梢蛇正品、12批金錢白花蛇正品、8批蘄蛇正品及其33批混偽品進(jìn)行快速PCR研究。蛇類樣品收集自廣東、江西、北京、安徽等地區(qū)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥標(biāo)本館張繼研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，見表1。
　　1.2 儀器 GeneAmp 9700型PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystem公司）； TC-512梯度PCR儀（TECHNE公司）；VeritiTM 96孔梯度PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司）；5810 R 型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）； VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀（Scientific industries 公司）；DYY-12 型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）； HE99X-15-1.5型電泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司）； ZF-7A型手持式紫外燈（上海谷村電子光學(xué)儀器廠）。
　　1.3 試劑 瓊脂糖購(gòu)自Promega公司；溴化乙啶購(gòu)自Fluka公司；rTaq DNA聚合酶、SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix購(gòu)自Roche有限公司、Transfast Taq DNA聚合酶購(gòu)自Transgen有限公司；10 000× SYBR Green I購(gòu)自Invitrogen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
　　2 方法
　　2.1 基因組總DNA的提取 取20 mg蛇類藥材粉末，使用堿裂解法^[8]提取總DNA，所提取DNA稀釋10倍用于PCR反應(yīng)。通用引物對(duì)Cytb-H /Cytb-L用于PCR反應(yīng)以檢測(cè)DNA質(zhì)量，25 μL PCR反應(yīng)體系，包含2.5 μL 10× buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，0.25 μmol·L^-1上游及下游引物、0.25 U SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、1 μL 20% PVP 40溶液、0.5 μL 10 g·L^-1 BSA溶液、1 μL （約10 ng） DNA 模板，反應(yīng)程序見表2。
　　2.2 PCR擴(kuò)增條件的確定 取樣品DNA用于確定快速PCR反應(yīng)條件。25 μL PCR反應(yīng)體系，包含2.5 μL 10× buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，0.25 μmol·L^-1上游及下游引物，0.25 U SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、1 μL 20% PVP 40溶液、0.5 μL 10 g·L^-1 BSA溶液、1 μL（約10 ng）DNA 模板。PCR反應(yīng)在GeneAmp 9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，初始反應(yīng)程序見表2。反應(yīng)結(jié)束后取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，加入2 μL 6× Loading buffer （Takara 公司） 混勻后于EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。
　　分別利用蛇類特異性鑒別引物對(duì)WuShao-F/WuShao-R，JinQian-F/JinQian-R，QiShe-F/QiShe-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，并考察退火溫度：61，63，65，67，69，71 ℃（烏梢蛇，蘄蛇）；60，62，64，66，68，70 ℃（金錢白花蛇）；PCR循環(huán)數(shù)：30，28，26，24，22個(gè)循環(huán)；變性溫度：94，92，90，88，86，84 ℃；變性和退火時(shí)間：20，10，5，3，1 s；Taq酶種類：r Taq DNA聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix，TransfastTaq DNA聚合酶；不同PCR儀：9700型PCR儀（ABI公司），VeritiTM 96孔梯度PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司），TC-512型PCR儀（TECHNE公司）。

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