葛根芩連方中多成分腸滲透性的原藥材歸屬研究
發(fā)布時(shí)間:2019-08-28 來(lái)源: 美文摘抄 點(diǎn)擊:
[摘要] 中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica,CMMBCS)構(gòu)建的復(fù)雜層面為中藥復(fù)方研究,在堅(jiān)持多成分同時(shí)測(cè)定的前提下,開展?jié)B透性研究時(shí),其首要任務(wù)是明確透過(guò)腸壁而被吸收的成分來(lái)源,即具體歸屬于中藥復(fù)方中的哪味藥材。該研究利用化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù)(chemical fingerprint),采用離體翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)經(jīng)典名方葛根芩連方中的腸滲透多成分進(jìn)行直觀來(lái)源歸屬,為下一步的腸滲透性定性及定量研究奠定基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞] 中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng);葛根芩連方;滲透性;離體翻轉(zhuǎn)腸囊;多成分;化學(xué)成分指紋圖譜
[收稿日期] 2014-07-18
[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473362);北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011-CXTD-13)
[通信作者] *董玲,副研究員,碩士生導(dǎo)師,主要從事新劑型給藥系統(tǒng)研究,Tel:(010)64286245,E-mail:dongling@bucm.edu.cn;*劉洋,副教授,碩士生導(dǎo)師, 主要從事藥物代謝研究,Tel:(010)84738629,E-mail:liuyang@bucm.edu.cn
[作者簡(jiǎn)介] 朱美玲,碩士研究生,E-mail:1049613109@qq.com
中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的分類依據(jù)中,滲透性是重要指標(biāo)之一,但因中藥成分的復(fù)雜性,尤其是中藥復(fù)方,需按照腸滲透成分歸屬、腸滲透成分定性和腸滲透成分定量分析的過(guò)程,逐步闡述。為堅(jiān)持中藥多成分整體性研究的原則,利用化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù),運(yùn)用單味藥材和復(fù)方交叉對(duì)比的方法,開展腸滲透多成分的原藥材歸屬研究是可行的。腸滲透性實(shí)驗(yàn)方法很多,通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)方法研究,因離體外翻腸囊法的多成分指紋圖譜直觀性最優(yōu),而被選中。該方法最初是由Wilson和Wiseman于1954年創(chuàng)建[1],具有直接、快速反映吸收行為,可控、簡(jiǎn)便調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)勢(shì),雖定量準(zhǔn)確性稍差,但卻是研究鎖定吸收成分的有效手段。葛根芩連方是源于《傷寒論》的經(jīng)典名方,由葛根、甘草、黃芩和黃連組成。目前對(duì)于其藥效成分和質(zhì)量控制具有廣泛而深入的研究報(bào)道[2-3],但對(duì)于其整體的多成分腸滲透性卻未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究對(duì)葛根芩連方進(jìn)行實(shí)驗(yàn),探索其組方各味藥材的主要成分在葛根芩連方的多成分環(huán)境下,是否可以被吸收,從而為下一步的多成分腸滲透性定性和定量分析提供基礎(chǔ)支撐。
1 材料
1.1 儀器
Waters液相色譜系統(tǒng)(600四元泵,美國(guó)Waters公司);2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器,Empower2工作站;電子分析天平(BT-25S,北京賽多利斯儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ-500DE,昆山超聲儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(DZKW-4,北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。
1.2 藥物
葛根、黃芩、黃連及甘草購(gòu)買于北京同仁堂藥店;葛根素對(duì)照品(批號(hào)110752-200912,中國(guó)食品藥品檢定研究院);葛根素原料(批號(hào)120504,陜西中鑫生物技術(shù)有限公司);黃芩苷原料(批號(hào)ZL-A-018,南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司);鹽酸小檗堿原料(批號(hào)120212,陜西中鑫生物技術(shù)有限公司);甘草酸單銨原料(批號(hào)GU20120611,武漢金諾化工有限公司)。
1.3 試劑
乙腈購(gòu)買于美國(guó)Fisher公司(色譜級(jí));乙酸、三乙胺、磷酸、氯化鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖購(gòu)買于北京化工廠(分析級(jí));娃哈哈純凈水購(gòu)買于娃哈哈集團(tuán)公司(中國(guó)杭州)。
1.4 動(dòng)物
Wistar大鼠,雄性,體重200~250 g,北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào) SCXK(京)2012-0001。
2 方法
2.1 葛根芩連方多成分色譜指紋圖譜分析方法的建立
采用高效液相色譜法測(cè)定,參照相關(guān)文獻(xiàn)[4],色譜條件為:Thermo Scientific,Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;柱溫室溫;進(jìn)樣量10 μL;緩沖溶液(1%三乙胺,1%乙酸,用磷酸調(diào)pH到3.0,A)-甲醇(B)進(jìn)行梯度洗脫(0~12 min,76%A;12~13 min,76%~72%A;13~19 min,72%A;19~20 min,72%~66.2%A;20~37.5 min,66.2%A;37.5~38.5 min,66.2%~59%A;38.5~60 min,59%~25%A)。
2.2 葛根芩連方及其組方藥材的離體翻轉(zhuǎn)腸囊法多成分吸收定性研究
2.2.1 人工腸液的制備 稱取葡萄糖0.7 g,氯化鎂0.01 g,磷酸二氫鈉0.16 g,氯化鈉3.9 g,氯化鉀0.175 g,氯化鈣0.185 g,碳酸氫鈉0.685 g,用蒸餾水定容于500 mL量瓶中,備用。
2.2.2 腸吸收藥液的制備 稱取復(fù)方中的各味藥材研成粉末(全部過(guò)20目篩),取適量用50%甲醇超聲提取1 h,時(shí)時(shí)振搖,將提取液濃縮至無(wú)甲醇味,加人工腸液制成一定濃度藥液,過(guò)0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液供HPLC分析。
2.2.3 大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸囊模型實(shí)驗(yàn)方法 采用禁食不禁水12 h的健康大鼠,水合氯醛麻醉,小心將腸管同腸系膜剝離,分別取小腸10 cm,放入37 ℃的人工腸液中,沖洗至無(wú)內(nèi)容物流出。小心剝離腸段表面的腸系膜和脂肪,將腸管一端結(jié)扎于自制塑料套管,小心將腸管翻轉(zhuǎn),向腸囊內(nèi)注入1 mL空白人工腸液,結(jié)扎另一端,放入37 ℃恒溫的藥液中,通入氧氣。孵育1 h后將腸囊取出,擦凈表面液體,傾出液體。過(guò)0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液供HPLC分析。
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