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        N—乙!5—羥色胺對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

        發(fā)布時(shí)間:2018-06-24 來源: 人生感悟 點(diǎn)擊:


          【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851(2018)03-0-01
          視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見的病理生理過程,嚴(yán)重影響患者的視覺功能[1]。缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚未明確,有研究證實(shí)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系[2,3]。N-乙酰-5-羥色胺(N-acetylserotonin,NAS)是一種自由基清除劑,對(duì)肝細(xì)胞、腦細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用[4]。有研究證實(shí)NAS可增加肝微粒體膜的穩(wěn)定性,課題組前期研究證實(shí)NAS可減輕肝缺血再灌注損傷小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的損傷,抑制肝細(xì)胞凋亡,改善肝臟功能[5,6]。但是近年來有關(guān)NAS對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注的保護(hù)作用報(bào)道較少。本研究擬通過觀察NAS對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,為開發(fā)治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的新藥、提高視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
          1 材料與方法
          1.1 材料
          1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年SD大鼠30只,體重300g左右,隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、缺血再灌注組(10只)以及NAS組(10只),正常對(duì)照組不加干預(yù),缺血再灌注組于造模前30min腹腔注射5mg/kg的生理鹽水,NAS組于造模前30min腹腔注射5mg/kg的NAS。
          1.1.2 主要試劑 NAS(Sigma公司,美國);HE染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,海門);兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Bax(Abcam公司,美國),免疫組化試劑盒(博奧森公司,北京)、DAB顯色劑(中杉金橋生物技術(shù)有限公司,北京)。
          1.2 方法
          1.2.1 RIRI模型制作 按照文獻(xiàn)報(bào)道,采用右眼生理鹽水前房加壓灌注法制作視網(wǎng)膜缺血再灌注模型[7]。
          1.2.2 組織切片制作 各組大鼠于RIRI 72 h后取眼球組織,4%多聚甲醛固定,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,將包埋好的標(biāo)本平行于視神經(jīng)矢狀軸進(jìn)行切片,切片厚約4μm。
          1.2.3 HE染色 石蠟切片脫蠟至水,蘇木素液染色,雙蒸水沖洗,1%鹽酸酒精分化,雙蒸水沖洗,梯度酒精脫水,伊紅染色,95%鹽酸酒精分色,無水酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。
          1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 90?C烤片2h,常規(guī)脫蠟至水,枸櫞酸鹽抗原修復(fù),3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,山羊血清封閉,加入兔抗大鼠Bcl-2(1:500)和兔抗大鼠Bax(1:500)一抗并4?C孵育過夜,PBS緩沖液沖洗,加入二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。
          1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
          2 結(jié)果
          2.1 HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰,各層細(xì)胞排列緊密;缺血再灌注組大鼠視網(wǎng)膜各層高度水腫,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逐漸減少且分布紊亂;NAS組較缺血再灌注組細(xì)胞水腫明顯減輕,細(xì)胞排列趨于規(guī)整,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少程度有顯著緩解。
          2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達(dá)的變化 正常對(duì)照組視網(wǎng)膜可見大量Bcl-2陽性細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)為1580±23.75個(gè)·mm-2;缺血再灌注損傷組Bcl-2陽性細(xì)胞顯著下降,細(xì)胞數(shù)為845±17.89個(gè)·mm-2;NAS組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)為1258±18.45個(gè)·mm-2,顯著多于缺血再灌注組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
          2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜Bax蛋白表達(dá)的變化 正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜Bax陽性細(xì)胞較少,細(xì)胞數(shù)為98.75±15.98個(gè)·mm-2;缺血再灌注組Bax陽性細(xì)胞數(shù)為869.78±18.97個(gè)·mm-2;NAS組Bax陽性細(xì)胞顯著少于缺血再灌注組,為125.85±28.49個(gè)·mm-2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
          3 討論
          N-乙酰-5-羥色胺(N-acetylserotonin,NAS)是一種自由基清除劑,對(duì)肝細(xì)胞、腦細(xì)胞等氧化損傷均具有保護(hù)作用[8]。SHAHAR等建立大鼠腸缺血再灌注損傷模型,觀察NAS對(duì)缺血再灌注后腸道細(xì)胞的保護(hù)作用,證實(shí)NAS可以抑制大鼠腸缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡,有效預(yù)防腸黏膜損傷[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NAS可減輕肝缺血再灌注損傷小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的損傷,改善肝臟功能,抑制肝細(xì)胞的凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)將NAS用于大鼠RIRI模型中,通過觀察大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變化以及Bcl-2蛋白和Bax蛋白的改變,研究NAS對(duì)大鼠RIRI后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
          HE染色結(jié)果證實(shí)正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰,各層細(xì)胞排列緊密;缺血再灌注組大鼠視網(wǎng)膜各層高度水腫,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逐漸減少且分布紊亂;NAS組較缺血再灌注組細(xì)胞水腫明顯減輕,細(xì)胞排列規(guī)整,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少程度有顯著緩解。Bcl-2家族成員在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白,可阻斷細(xì)胞色素C的釋放,抑制下游凋亡反應(yīng),而Bax是促凋亡蛋白,通過與Bcl-2而封閉其活性,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10,11]。本研究證實(shí)NAS組RIRI后Bcl-2陽性細(xì)胞顯著多于缺血再灌注組,提示經(jīng)NAS干預(yù)后Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)。缺血再灌注損傷組RIRI后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層可見Bax陽性細(xì)胞,NAS組Bax陽性細(xì)胞顯著少于缺血再灌注損傷組,證實(shí)在NAS的作用下Bax蛋白表達(dá)降低。提示NAS抑制RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)并抑制Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。
          總之,NAS可促進(jìn)RIRI后大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達(dá),抑制Bax蛋白表達(dá),從而減輕細(xì)胞凋亡,具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,為臨床治療RIRI提供了新思路和研究方法。

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