摘 要：目的是建立一種快速檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的液相芯片檢測方法。采用基于間接競爭法的原理，將3種細菌抗原分別與不同的聚苯乙烯微球偶聯(lián)，以藻紅蛋白（PE）熒光標記二抗為信號，優(yōu)化反應條件，對建立的方法進行靈敏度、特異性和可重復性驗證。結果顯示，3種細菌檢測抗體最佳加入量分別為10ng、10ng、5ng，建立的方法檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的最低檢測限均可達到103 CFU/mL，檢測其他常見食源性致病菌無交叉反應。結論表明，建立了一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的液相芯片檢測方法，能夠應用于實際樣品的檢測。
　　關鍵詞：單增李斯特菌 副溶血弧菌 沙門氏菌 液相芯片 檢測
　　前言
　　近年來，食源性疾病已成為世界上最突出、最廣泛的食品安全問題，病原微生物引起的食源性疾病則是影響食品安全的最主要因素之一[ 1 ]。微生物性食物中毒事件主要由食物污染或變質、生熟交叉污染等原因引起，且氣溫較高、氣候潮濕的環(huán)境適于細菌生長繁殖，導致食物易于腐敗變質，一旦儲存、加工不當，極易發(fā)生由沙門氏菌、副溶血性弧菌等微生物引起的食物中毒�，F(xiàn)行檢測手段已無法滿足日常對食源性致病菌檢測的需要，目前檢驗檢疫工作中常用于檢測和鑒定食源性致病菌的方法主要有PCR、Southem Blot雜交、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等一些簡單的分子生物學和免疫學方法[ 2 ]�，F(xiàn)行的檢測方法一般以檢測致病菌為主，需要增菌培養(yǎng)，檢測時間長，無法滿足高通量的檢測要求，遠不能滿足食品檢測的需要，市場迫切需要能同時檢測食源性致病菌的靈敏度更高、特異性更強、簡便快捷的高通量技術和方法[ 3 ]。因此，目前迫切需要發(fā)展一種快速、準確的方法來檢測和追蹤病原體和污染物的來源[4]。
　　液相芯片技術是在流式細胞技術、酶聯(lián)免疫吸附技術和傳統(tǒng)芯片技術基礎上開發(fā)的新一代生物芯片技術和新型蛋白質研究平臺，能同時檢測多種致病菌。邱楊等[ 5 ]通過該法建立了對沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片檢測方法，檢測靈敏度達到50～100copies/mL。郭啟新等[ 6 ]建立了對金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的檢測方法，具有很好的特異性，檢測靈敏度分別達38、44、21CFU/mL。Sun等[ 7 ]利用該法建立了高通量的同時檢測6種食源性致病菌的方法，檢測靈敏度達到20.4×103CFU/mL，遠高于PCR。
　　但基于多重PCR的液相芯片技術對單管樣本進行大量不同指標的高通量多重PCR方法建立仍存在困難，至今鮮見液相芯片用于檢測多種致病菌方法建立的相關報道。將液相芯片技術應用到食源性致病菌檢測中，可在短時間內實現(xiàn)對多個樣品同時進行多種致病菌靈敏、準確的檢測，因而有望大大提高食源性致病菌的檢測效率，在有效控制食物中毒事件的發(fā)生、食品安全控制、海關進出口檢驗檢疫、臨床診斷等方面具有廣闊的應用前景。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　Luminex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國Luminex公司）；4625型孔板振蕩器；ST16R冷凍離心機（美國Thermo公司）；編號No.18、No.29、No.52的微球（美國Luminex公司）。活化緩沖液：0.1mol/L NaH2P04- N a2 HP04，pH6.2；磷酸鹽緩沖液（PBS）：138mmol/L NaCI，2.7mmol/L KCl，8mmol/ L Na2HP04，1.5mmol/L KH2P04，pH7.4；洗滌緩沖液：PBS，0.05%Tween-20，pH7.4；分析緩沖液：PBS，1%BSA，pH7.4；封閉緩沖液：50mmol/L Tris，153mmol/L NaCl，2%BSA，0.05%Tween-20，pH7.4；儲存緩沖液：PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%疊氮化鈉，pH7.4。菌種為本實驗室保藏與西北農林科技大學食品實驗室饋贈。
　　1.2 方法
　　1.2.1 微球偶聯(lián)抗原
　�、偃∥⑶�50μL（1.25×106個/mL）置于EP管，14000g離心4min，棄上清液。
　�、诩尤�40μL活化緩沖液重懸微球，漩渦混合30s。
　�、奂尤�50mg/mL NHS和EDC各5μL，混勻，避光室溫下旋轉混合600rpm，20min。
　�、芗尤�150μL PBS，漩渦混合10s，14000g離心4min，棄上清液。
　　⑤用PBS洗滌3次后，加入150μL PBS重懸，再加入抗原，用PBS補齊至500μL，避光室溫旋轉混合600rpm，2h。
　�、�14000g離心4min，棄上清液。
　�、呒尤�150μL封閉緩沖液，漩渦混合15s，避光室溫旋轉混合600rpm，30min。
　�、�16000g離心4min，棄上清液，加入100μL儲存緩沖液4℃保存偶聯(lián)的微球�？乖�加入量為50ng。1.2.2 檢測
　�、偃〕雠悸�(lián)微球，恢復至室溫后漩渦30s。
　�、�96孔板中加入100μL PBS預濕實驗孔，抽去孔內液體，每孔中加入適量預混好的偶聯(lián)微球（約2000個），用150μL PBS洗滌兩次。
　　③將適量標準品或樣品分別加入合適的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入適量的抗體，用PBS補齊各孔至100μL。
　�、苡靡埔浩鞣磸统槲�混勻孔內溶液，避光條件下37℃，600rpm振蕩60min。
　�、莘磻�完畢后，抽去孔內液體，用150μL PBS洗滌兩次。
　　⑥每孔中加入100μL經(jīng)適當稀釋的PE標記二抗，移液器反復抽吸混勻。
　�、弑芄鈼l件下，37℃，600rpm振蕩45min后，抽去孔內液體，用150μL PBS洗滌兩次。

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