炙甘草藥材指紋圖譜研究
發(fā)布時(shí)間:2019-08-28 來源: 散文精選 點(diǎn)擊:
[摘要] 采用Agilent TC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),以乙腈-水(含0.2%甲酸)為流動(dòng)相梯度洗脫建立了炙甘草藥材的HPLC指紋圖譜,并采用HPLC-MS/MS對(duì)19個(gè)共有峰中的6個(gè)色譜峰進(jìn)行了定性鑒別。采用該方法測(cè)定了10批不同產(chǎn)地的炙甘草藥材,其相似度在0.72~0.99。該方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好,該研究為炙甘草藥材的質(zhì)量控制提供了參考。
[關(guān)鍵詞] 炙甘草; HPLC; 指紋圖譜; 質(zhì)量控制
[收稿日期] 2014-02-11
[基金項(xiàng)目] 國家 “重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項(xiàng) (2011ZX09201-201-13,2012ZX09301003-001-004,2013ZX09508-105)
[通信作者] 喬善義,研究員,碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞旨百|(zhì)量控制,Tel:(010)66930634,E-mail:crbj611202@sina.com
[作者簡介] 孫磊,實(shí)驗(yàn)師,Tel:(010)66930634, E-mail:rubyslsl@126.com
甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖除去雜質(zhì)、洗凈、潤透并干燥的炮制品,炙甘草是生甘草按照蜜炙法炒至黃色至深黃色的炮制品[1]。甘草素有“十方九草”之謂,具有清熱解毒,補(bǔ)氣益脾胃,潤肺祛痰,緩急止痛,調(diào)和諸藥的作用[2],而炙甘草雖基原與甘草相同,但經(jīng)炮制后,其性味功效也有區(qū)別,炙甘草具有補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈的功效,與生品相比增強(qiáng)了補(bǔ)脾益氣的作用[3]。
中藥化學(xué)成分指紋圖譜是指中藥材或中成藥經(jīng)適當(dāng)?shù)那疤幚砗,采用一定的分析手段得到的能夠?biāo)志該中藥材或中成藥特征的色譜圖或光譜圖,F(xiàn)行炙甘草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),僅測(cè)定甘草苷和甘草酸這2個(gè)指標(biāo)成分的含量,往往不能全面的反應(yīng)炙甘草的質(zhì)量,指紋圖譜技術(shù)從中藥藥效來自多種化學(xué)物質(zhì)綜合作用的觀點(diǎn)出發(fā),與測(cè)定單一組分相比,能夠提供更豐富、有效的質(zhì)量信息,因此指紋圖譜技術(shù)可以更客觀、科學(xué)、合理地進(jìn)行中藥質(zhì)量控制。本課題組對(duì)中藥經(jīng)典方劑小柴胡湯的指紋圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究[4-5],炙甘草是小柴胡湯方劑的重要組成部分,對(duì)各單味藥材的HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究是實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥方劑全面質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。對(duì)于炙甘草藥材的指紋圖譜研究,已有部分文獻(xiàn)進(jìn)行了報(bào)道[3,6],但對(duì)于炙甘草指紋圖譜中共有峰的定性鑒別,尚未見相關(guān)報(bào)道,本文采用HPLC,建立了炙甘草藥材的高效液相色譜指紋圖譜,同時(shí)采用HPLC-MS/MS方法對(duì)部分色譜峰進(jìn)行了指認(rèn),為炙甘草指紋圖譜中的成分確認(rèn)及其質(zhì)量控制提供了參考。
1 材料
日立L-2000高效液相色譜儀;Agilent 6330離子阱質(zhì)譜儀,配有Agilent 1100液相色譜儀;北京長風(fēng)HW·SY-K4型智能電熱恒溫水浴鍋;KQ2200E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);東京理化N-1001D-WA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;Sartorius-BS 124S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);安徽科大中佳SC-3614型離心機(jī)。
水為娃哈哈純凈水;乙腈和甲醇均為色譜純;其余試劑為分析純。10批不同來源炙甘草見表1。
2 方法與結(jié)果
2.1 對(duì)照品溶液制備
稱取上述G1~G10號(hào)炙甘草樣品各10 g,加入10 倍量蒸餾水回流提取2 次,每次2 h,過濾,合并2次濾液。將濾液濃縮至1 mL藥液相當(dāng)于6 g生藥,加入適量無水乙醇,至溶液中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%,均勻攪拌,靜置過夜,離心(25 min,2 500 r·min-1),用70%乙醇洗滌沉淀,離心(25 min,2 500 r·min-1),合并上清,濃縮除去乙醇,將得到的提取物70 ℃真空干燥,得到炙甘草樣品。精密稱取上述樣品0.030 0 g,用50%色譜純甲醇定容至10 mL量瓶中,0.45 μm微孔濾膜過濾,得到炙甘草供試品溶液,進(jìn)行HPLC分析。
2.2 色譜條件
色譜柱為Agilent TC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);以乙腈(A)-水(B,含0.2%甲酸)為流動(dòng)相,梯度洗脫,見表2;流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長265 nm;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量20 μL。
2.3 質(zhì)譜條件
離子源為ESI源,負(fù)離子掃描模式,霧化氣壓力為2.7×105 Pa,干燥氣流量為10.0 L·min-1,離子源溫度為350 ℃,碎裂電壓1。梯度洗脫程序同2.2。
2.4 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的指認(rèn)
2.4.1 指紋圖譜的建立 取2.1項(xiàng)制備的供試品溶液各20 μL,按照2.2項(xiàng)所述條件下進(jìn)行測(cè)定,得到10批不同來源炙甘草HPLC指紋圖譜,根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間,確定共有峰,并選取其中19個(gè)特征色譜峰,建立的HPLC共有模式圖見圖1。
2.4.2 共有指紋峰的指認(rèn) 為進(jìn)一步闡明炙甘草的化學(xué)組成,采用HPLC-MS/MS技術(shù)并結(jié)合文獻(xiàn),對(duì)HPLC指紋圖譜19個(gè)特征色譜峰中的6個(gè)色譜峰進(jìn)行了推測(cè),見表3。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 精密度試驗(yàn) 取2.1項(xiàng)下同一供試品溶液按2.2項(xiàng)下所述條件連續(xù)測(cè)定6次,考察各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.50%,相對(duì)峰面積RSD<10%,表明儀器穩(wěn)定,精密度良好。
2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.1項(xiàng)下同一供試品溶液按2.2項(xiàng)下所述條件,分別在0,2,4,6,12,24 h測(cè)定其指紋圖譜,考察各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.70%,相對(duì)峰面積RSD<10%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
熱點(diǎn)文章閱讀