專題 2 微生物的培養(yǎng)與應用

　在繽彩紛呈的生物世界，微生物似乎顯得過于微小與沉寂。然而，它們在自然界卻作用非凡！

　生物學發(fā)展的歷史表明，諸多革命性地改變人類對生命的認識的事件，都與微生物有著千絲萬縷的聯(lián)系。例如，自然發(fā)生說的破滅，酶的原始概念“酵素”的提出，肺炎雙球菌轉化實驗證明 DNA是遺傳物質，青霉素的發(fā)現，第一個雜合 DNA分子的體外構建„„ 在借助顯微鏡第一次直面微生物之后，一代又一代科學家建立、發(fā)展和完善了微生物技術。課題 1將帶領我們學習這些技術中最基本、最核心的微生物培養(yǎng)技術。在此基礎上，我們不妨也嘗試一下本專題中的其他課題。相信在逐步深入的探索中，你能充分體會到動手動腦做科學的樂趣。

　課題 1 微生物的實驗室培養(yǎng) 課題背景 19 世紀中期，關系到法國經濟命脈的釀造業(yè)曾一度遭受殷滅性的打擊。在生產過程中，出現了葡萄酒變酸、變味的怪事。經過一番研究，法國科學家巴斯德發(fā)現，導致生產失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們認識到保持培養(yǎng)物純凈的重要性。

　防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應用微生物的前提。在實驗室培養(yǎng)微生物，一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保無處不在的其他微生物無法混入。在本課題中，我們將通過培養(yǎng)大腸桿菌（ Escherichia coil ）的實驗，學習微生物培養(yǎng)的基本技術。

　基礎知識 （一）培養(yǎng)基 人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質——培養(yǎng)基（culture media）。其中，配制成的液體狀態(tài)的基質稱為液體培養(yǎng)基，配制成的固體狀態(tài)的基質稱為固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基，它是實驗室中最常用的培養(yǎng)基之一。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落（圖 2-1）。

　 雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物質）、氮源（提供氮元素的物質）和無機鹽。回憶有關活細胞中元素組成的知識，想一想為什么大多數培養(yǎng)基都含有這四類物質。下面讓我們一起來看一看某種細菌培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成。

　在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質的基礎上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對 pH、特殊營養(yǎng)物質以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時需將培養(yǎng)基的 pH調至酸性，培養(yǎng)細菌時需將 pH調至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧微生物時則需要提供無氧的條件。

　? 瓊脂（agar）是一種從紅藻中提取的多糖。瓊脂在 98℃以上熔化，在 44℃以下凝固，在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈現固態(tài)。

　? 牛肉膏和蛋白胨來源于動物原料，含有糖、維生素和有機氮等營養(yǎng)物質。

　? 你想知道固體培養(yǎng)基的來歷嗎？請點擊人教網 www.pep.com.cn 查詢。

�。ǘ�）無菌技術 獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵。無菌技術圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下幾個方面。

　1.對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒（disinfection）

　。

　2.將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌（sterilization）。

　3.為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。

　4.實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

　無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？ ? 消毒是指使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。下面，我們重點學習消毒和滅菌的方法。

　實驗室常用的消毒和滅菌方法 在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。

　消毒方法 日常生活中經常用到煮沸消毒法。在 100℃煮沸 5~6min 可以殺死微生物細胞和一部分芽孢。對于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在 70~75℃煮 30min 或在 80℃煮 15 min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。此外，人們也常使用化學藥劑進行消毒，如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。

　灼燒滅菌 將微生物的接種工具，如接種環(huán)、接種針或其他金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速徹底地滅菌（圖 2-2）。此外，在接種過程中，試管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通過火焰灼燒來滅菌。

　干熱滅菌

　將滅菌物品放入干熱滅菌箱（圖 2-3）內，在 160~170℃加熱 1~2 h 可達到滅菌的目的。能耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培養(yǎng)皿）和金屬用具等，可以采用這種方法滅菌。干熱滅菌的具體操作步驟參見附錄 4。

　高壓蒸汽滅菌

　將滅菌物品放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋（圖 2-4 ）內。把鍋內的水加熱煮沸，將其中原有的冷空氣徹底排除后，將鍋密閉，繼續(xù)加熱使鍋內的氣壓逐步上升，溫度也隨之升到 l00℃以上。為達到良好的滅菌效果，一般在壓力為 100 kPa，溫度為 121℃的條件下，維持 15~30min。高壓蒸汽滅菌的具體操作步驟參見附錄 4。

　除了以上方法外，實驗室里還用紫外線或化學藥物進行消毒。例如，接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射 30 min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強消毒效果。實驗室中常用的其他化學消毒劑，參見附錄 5。

　清你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。

　1.培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿。

　2.玻棒、試管、燒瓶和吸管。

　3.實驗操作者的雙手。

　實驗操作 ? 教學用的大楊桿菌可以到國家指定的菌種保藏中心購買。

　本實驗用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進行大腸桿菌的純化培養(yǎng)，可分成制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌兩個階段進行。

�。ㄒ唬┲苽渑Ｈ飧嗟鞍纂斯腆w培養(yǎng)基 1. 計算

　根據牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計算配制 100mL 的培養(yǎng)基時，各種成分的用量。

　? 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方 牛肉膏

　 5.0g 蛋白胨

　 10.0g NaCl

　5 .0g 瓊脂

　20 .0g 將上述物質溶解后，用蒸餾水定容至 1 000 mL。

　2. 稱量

　準確地稱取各種成分。牛肉膏比較粘稠，可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。

　3. 溶化

　將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯，加入少量的水，加熱。當牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻棒取出稱量紙。往燒杯中加入稱量好的蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其溶解。加入瓊脂，加熱使其熔化。在此過程中，不斷用玻棒攪拌，防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。當瓊脂完全熔化后，補加蒸餾水至 100mL 。

　4. 滅菌

　將配制好的培養(yǎng)基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓滅菌鍋，在壓力為 100kPa、溫度為 121℃條件下，滅菌 15~30min。將培養(yǎng)皿用幾層舊報紙包緊，5~8套培養(yǎng)皿作一包，包好后放入干熱滅菌箱內，在 160~170℃下滅菌 2 h。

　5. 倒平板

　待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作描述如下。

　倒平板操作 1.將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

　2.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。

　3.用左于將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約 10~20mL）倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

　4.等待平板冷卻凝固（大約需 5~10min）后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下、皿底在上。

　討論 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到 50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ （二）純化大腸桿菌 微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。請你選用其中的一種方法，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上純化大腸桿菌。

　? 微生物的接種技術還包括斜面接種、穿刺接種等方法。雖然這些技術的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止雜菌的污染，保證培養(yǎng)物的純度。

　平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落（colony）。

　1.將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。

　2.在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開盛有菌液的試管的棉塞。

　3.將試管口通過火焰。

　4.將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取一環(huán)菌液。

　5.將試管口通過火焰，并塞上棉塞。

　6.左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。

　7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。

　討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？ 3.在做第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 稀釋涂布平板法則是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。

　系列稀釋操作

　1.將分別盛有 9mL水的 6 支試管滅菌，并按 10 1 ~10 6 的順序編號。

　2.用移液管吸取 1 mL 培養(yǎng)的菌液，注入 10 1 倍稀釋的試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌液與水充分混勻。

　3.從 10 1 倍稀釋的試管中吸取 1 mL 稀釋液，注入 10 2 倍稀釋的試管中，重復第 2 步的混勻操作。依次類推，直到完成最后一支試管的稀釋。

　注意：移液管需要經過滅菌。操作時，試管口和移液管應在離火焰 1~2cm處。

　涂布平板操作

　l.將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。

　2.取少量菌液（不超過 0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。

　3.將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻 8~10s。

　4.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使菌液分布均勻。

　注意：1.將涂布器末端浸在盛有體積分數為 70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

　2.操作中一定要注意防火！不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。

　討論 涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第 2步應如何進行無菌操作？ 將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基都放入 37℃恒溫箱中，培養(yǎng) 12h 和 24 h 后，分別觀察并記錄結果。

　結果分析與評價 1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？ 2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，你是否觀察到了獨立的菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小相似嗎？ 3.培養(yǎng) 12 h和 24 h 后，觀察到的實驗結果相同嗎？如果不同，請分析產生差異的原因。

　4.如果你在培養(yǎng)基上觀察到了不同形態(tài)的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？ 5.你是如何記錄實驗結果的？與其他同學交流互評。

　課題延伸 為了保持菌種的純凈，需要進行菌種的保藏。對于頻繁使用的菌種，我們可以采用臨時保藏的方法。首先，將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當菌落長成后，將試管放入 4℃的冰箱中保藏（圖 2-5）。以后每 3~6 個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉移到新鮮的培養(yǎng)基上。但是，這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產生變異。

　對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，裝人 1 mL 甘油后滅菌。將 1 mL 培養(yǎng)的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保存。

　練習 習 1.請你想一想，日常生活中保存食品的方法有哪些？這些方法是如何阻止或抑制微生物生長的？

　2.無土栽培技術是用人工配制成的培養(yǎng)液來栽培植物；植物組織培養(yǎng)技術則是將植物體的組織接種在培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)；而在本課題中，我們著重學習了微生物的培養(yǎng)技術。請你比較這三種培養(yǎng)技術在設計思路和具體操作上的異同。

　3.巴斯德設計的鵝頸瓶實驗有力地駁斥了“自然發(fā)生論”，證明微生物只能由微生物產生，不能從沒有生命的物質自然產生。請你解釋其實驗原理，并分析這個實驗對于微生物學的進步、微生物學的研究方法以及食品保存等方面所產生的影響。

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