摘要：為較全面的了解云南復烤煙葉在不同地點醇化過程中真菌多樣性，挖掘其中的有益微生物，提高煙草醇化品質(zhì)，以復烤煙葉為試驗材料，利用18S rDNA克隆測序技術，系統(tǒng)研究了其醇化過程中可培養(yǎng)真菌的種群結構。結果表明，醇化過程中，復烤煙葉葉面真菌數(shù)量除曲靖倉庫在6月有所上升外，其余各地均隨著醇化的進行而逐漸下降，其中曲靖和楚雄兩地非常接近，元江最少；通過形態(tài)特征及18S rDNA鑒定，煙葉葉面真菌包括根霉屬真菌、青霉屬真菌、曲霉屬真菌等24個真菌屬（種）。不同地點，不同時期煙葉葉面真菌的數(shù)量、種類及優(yōu)勢種群不盡相同，而根霉屬真菌始終為優(yōu)勢種群。
　　關鍵詞：復烤煙葉；醇化；真菌：18S rDNA
　　煙葉是一種經(jīng)濟價值較高的商品，是卷煙工業(yè)的主要原料。由于當年復烤的煙葉存在刺激性大、青雜氣重、煙氣粗糙、余味澀口、香氣不夠顯露等特點，不適宜直接進行卷煙生產(chǎn)，需經(jīng)過一段時間的醇化來改善煙葉化學成分協(xié)調(diào)性及評吸質(zhì)量，從而達到生產(chǎn)標準。在煙葉醇化過程中，微生物及其產(chǎn)生的酶發(fā)揮著極其關鍵的作用微生物不僅可以通過自身的生命活動作用于煙葉醇化過程，還可通過其代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應，促進煙葉中生物大分子的轉化。有研究表明，將微生物或酶用于煙葉醇化可縮短醇化時間，提高煙葉品質(zhì)和改善煙氣特性。相反，如果醇化過程中某類微生物過度繁殖，則會影響煙葉醇化品質(zhì)，后續(xù)的卷煙生產(chǎn)及質(zhì)量控制。因此，研究醇化過程中微生物的變化規(guī)律，對調(diào)控微生物作用，提高醇化效率，乃至揭示煙葉醇化機理具有重要意義。關于煙葉醇化過程中微生物變化已有不少研究，但關于復烤煙葉不同地點醇化其葉面微生物的變化卻鮮有報道。
　　云南是我國煙草原料大省，然而云南立體氣候特點明顯、不同地區(qū)生態(tài)條件差異顯著，勢必影響到微生物群落結構差異，從而對煙葉醇化品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。但目前尚未見關于云南復烤煙葉不同地點醇化過程中葉面可培養(yǎng)真菌群落結構的比較研究�；�于此，本研究對置于彌勒、曲靖、元江、楚雄4地的紅花大金元復烤煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量、種類及其動態(tài)變化規(guī)律進行研究，為進一步研究煙葉醇化機理和人工調(diào)控煙葉醇化進程提供依據(jù)。
　　1材料與方法
　　1.1供試材料
　　本試驗所用的煙葉為紅云紅河集團及紅塔集團2014年的紅花大金元復烤煙葉，共選取7個樣品進行試驗，分別為昆明WDB2F及WDC3F、曲靖WDC3F及WBBSF、紅河WDC3F及WBBSF、大理VC02S。
　　1.2醇化地點及氣候條件
　　所有供試紅花大金元（簡稱紅大，HD）復烤煙葉樣品均分別入庫彌勒、曲靖、元江和楚雄4個倉儲地。彌勒煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為73.3%，曲靖煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為58.2%，元江煙葉倉庫的年平均氣溫24.36℃、濕度為65%，楚雄煙葉倉庫的年平均氣溫20.5℃、濕度為59.6%。
　　1.3取樣及真菌分離
　　于2015年4、10月：2016年1、7、9月于每個醇化地同步采集自然醇化了0、6、9、15和17個月的煙草樣品，采用無菌袋（1500 g/袋）密封包裝，每地7個樣，共140個樣品，測定煙葉葉面真菌種類及數(shù)量。
　　在無菌條件下，從每個煙葉樣品中隨機選取50個煙葉片段，然后用無菌剪刀剪成1cmx1cm大小組織塊，并從中隨機取30個組織塊貼于PDA平板上（10個組織塊/平板，平板直徑為90mm），28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～55 d，隔天觀察，發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有真菌長出，則將其挑取并轉接到新鮮PDA平板上，純化后接于PDA斜面進行分類、鑒定及保藏。
　　1.4菌株鑒定
　　1.4.1形態(tài)學鑒定根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長速率、質(zhì)地和分泌物狀態(tài)與顏色等，將分離得到的真菌分為不同的形態(tài)類群（morphotype）之后，從各類群中隨機挑取3-5株接種于PDA平板上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，通過對孢子形態(tài)結構與大小、產(chǎn)孢方式與產(chǎn)孢結構等特征來確定菌株的分類地位。對于不產(chǎn)孢的菌株，則進行促孢培養(yǎng)，產(chǎn)孢后按上述方法進行鑒定。對于利用各種方法促孢后仍然不產(chǎn)孢的類群，則依據(jù)菌落質(zhì)地、顏色、生長速率，菌絲顏色、粗細和結構等特征劃分為不同的無孢類群組（mycelia sterile）。
　　1.4.2分子鑒定
　　對于那些不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢后仍不能確定其分類地位的菌株，則通過測定其18S rDNA序列，并與Genebank上的序列比對后，再結合其形態(tài)特征來確定其分類地位。具體做法為：將供試菌株從斜面轉接到PDA平板上進行活化，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取菌株基因組DNA。隨后利用真菌ITS通用引物ITSl（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，合格后送碩擎生物科技有限公司進行測序。所得序列與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的序列進行比對，根據(jù)覆蓋率和相似度并結合形態(tài)學特征確定其分類地位。
　　2結果
　　2.1煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量及其動態(tài)變化
　　從彌勒、曲靖、元江、楚雄4個醇化地、5個不同醇化時間點的140個煙葉樣品的4200個煙葉片段中，共分離得到1636株真菌，其在醇化過程中各醇化地的分布及變化見圖1。由圖1可知，煙葉經(jīng)過一段時間的醇化后，除曲靖和楚雄兩地在醇化9個月后煙葉葉面真菌數(shù)量非常接近外，各醇化地煙葉葉面真菌數(shù)量差異較大，但總體而言，在各個醇化時間點都是元江煙葉葉面的真菌數(shù)量低于其他3個醇化地（醇化17個月后略高于彌勒）。且除曲靖醇化煙葉葉面真菌數(shù)量在醇化6個月時有所上升外，各醇化地煙葉葉面真菌的數(shù)量均隨著醇化時間的延長而降低。
　　2.2煙葉葉面可培養(yǎng)真菌種類及其動態(tài)變化

相關熱詞搜索：種群 真菌 煙葉 云南 過程中