實(shí)驗(yàn)室 作業(yè)指導(dǎo)書 文件編號：SWAQ-PCR-3-2018

　第 第 A 版

　編制：

　沈龍華

　審核：

　魯君艷

　批準(zhǔn)：

　姜志剛

　生效日期：2018 年 年 05 月 月 05 日 永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：AQSC-PCR-3-2018

　版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 目 錄 生效日期：20180505

　第 2 頁， 共 37 頁

　 目

　 錄 章節(jié) 名

　稱 頁碼 01 目錄 2 02 修訂頁 3 03 實(shí)驗(yàn)室工作流程標(biāo)準(zhǔn)操作程序 4 04 標(biāo)本接收/拒收標(biāo)準(zhǔn)操作程序 5 05 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序 6 06 實(shí)驗(yàn)耗材消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序 7 07 實(shí)驗(yàn)室清潔消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序 8 08 PCR 擴(kuò)增儀標(biāo)準(zhǔn)操作程序 9 09 生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作程序 12 10 乙型肝炎病毒核酸定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序 14 11 腸道病毒 71 型核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序 18 12 丙型肝炎病毒 RNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序 22 13 高危型人乳頭瘤病毒 DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　26 14 肺炎支原體 DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　31 15 沙眼衣原體 DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　34

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　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：AQSC-PCR-3-2015

　版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 修訂頁 生效日期：20151010

　第 3 頁， 共 37 頁 修訂頁

　序號 修訂內(nèi)容 批準(zhǔn)人 修訂時(shí)間

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR01001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 工作流程標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　 第 4 頁 共 37 頁 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作流程標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　目的：規(guī)范臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室日常工作流程，確保實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)操作的標(biāo)準(zhǔn)化，規(guī)范化 范圍：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 日常工作流程：

　 一、標(biāo)本處理流程 1.1、掃碼接收：標(biāo)本經(jīng)標(biāo)本接收室掃條碼核收后進(jìn)入臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 1.2、標(biāo)本編號：對所有標(biāo)本進(jìn)行編號處理，并按次序做好標(biāo)識；在 LIS 系統(tǒng)中對標(biāo)本掃條碼或手工編號建檔，仔細(xì)核對每一標(biāo)本及其相對應(yīng)的化驗(yàn)申請單或標(biāo)本條碼標(biāo)簽上的信息：患者姓名、科別、床號，檢驗(yàn)項(xiàng)目及標(biāo)本質(zhì)量 1.3、標(biāo)本處理：

　1.3.1

　血液標(biāo)本 3000 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘，吸取上清液于 1.5ml 滅菌離心管內(nèi)待檢（如非當(dāng)日檢測標(biāo)本則需放于-20℃冷凍冰箱保存）。

　1.3.2

　分泌物或咽拭子標(biāo)本加 1ml 生理鹽水后于振蕩器上振蕩混勻一分鐘，吸取上清液于1.5ml 滅菌離心管內(nèi)待檢（如非當(dāng)日檢測標(biāo)本則需放于-20℃冷凍冰箱保存）。

　1.3.3

　乳汁標(biāo)本 3000 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘，吸取上清液于 1.5ml 滅菌離心管內(nèi)待檢（如非當(dāng)日檢測標(biāo)本則需放于-20℃冷凍冰箱保存）。

　1.4、將上述標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理后進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

　二、 檢測流程 2.1、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境檢查，做好相應(yīng)的溫度、濕度記錄 2.2、儀器檢查及維護(hù)并做好相應(yīng)記錄 2.3、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的試劑、耗材 2.4、檢測標(biāo)本擴(kuò)增前預(yù)處理 2.5、將預(yù)處理好的標(biāo)本按要求放于擴(kuò)增儀上，按相應(yīng)程序進(jìn)行基因擴(kuò)增 2.6、擴(kuò)增結(jié)束后，審核實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2.7、整理工作臺面，做好檢測后儀器維護(hù)保養(yǎng)工作 三、結(jié)果報(bào)告流程

　 分析核準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果：分析當(dāng)日檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)、陰陽性對照、質(zhì)控及標(biāo)準(zhǔn)品等結(jié)果是否符合要求；反應(yīng)曲線是否正常；檢測結(jié)果是否異常需要復(fù)查。如無誤則對當(dāng)日各檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行核準(zhǔn)，發(fā)出檢測報(bào)告。否則進(jìn)行復(fù)查等處理 四、檢測結(jié)束工作流程 4.1 當(dāng)日檢驗(yàn)結(jié)束后關(guān)閉儀器及水源、電源，整理工作臺面，對各項(xiàng)設(shè)備進(jìn)行日維護(hù)保養(yǎng) 4.2 將已檢驗(yàn)標(biāo)本做好日期標(biāo)記后放入已檢測標(biāo)本存儲冰箱，放置一周后再交衛(wèi)生員處理 SOP 文件的更改

　 該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

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　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR01002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 標(biāo)本接收/ / 拒收標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 5 頁 共 37 頁 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收/ / 拒收標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、 目的：規(guī)范臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的接收與拒收工作，做好檢測前質(zhì)量控制。

　二、 范圍：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

　三、 標(biāo)本接收程序內(nèi)容

　標(biāo)本經(jīng)標(biāo)本接收室掃條碼核收送至實(shí)驗(yàn)室后，由實(shí)驗(yàn)人員驗(yàn)收。驗(yàn)收要求有：

　3.1 標(biāo)本唯一性是否正確無誤，即標(biāo)本是否貼有條碼及條碼是否清晰或標(biāo)本標(biāo)簽與申請單標(biāo)

　 簽是否相符 3.2 申請檢驗(yàn)項(xiàng)目與標(biāo)本是否相符合 3.3 標(biāo)本采集保存容器是否正確、容器有無破損 3.4 檢查標(biāo)本的外觀是否異常（包括:有無溶血、有無乳糜狀、抗凝血標(biāo)本中有無凝塊等及標(biāo)

　 本量是否足夠）。

　3.5 檢查標(biāo)本采集時(shí)間與接收時(shí)間之間的時(shí)間間隔是否符合要求 3.6 如果標(biāo)本不符合驗(yàn)收要求，則對標(biāo)本進(jìn)行拒收

　四、 標(biāo)本拒收程序內(nèi)容

　 如在標(biāo)本驗(yàn)收中發(fā)現(xiàn)有以下不符合要求項(xiàng)時(shí)，則對此標(biāo)本進(jìn)行拒收，將其退回該標(biāo)本的送檢科室及送檢者，要求重新采集標(biāo)本送檢 4.1 唯一性標(biāo)志錯(cuò)誤或條碼、標(biāo)簽不清晰以及標(biāo)簽有脫落的標(biāo)本 4.2 用錯(cuò)標(biāo)本容器（如用錯(cuò)真空采血管等）或容器有破損的標(biāo)本 4.3 溶血標(biāo)本，乳糜血標(biāo)本 4.4 抗凝血有凝塊標(biāo)本，未按要求抗凝標(biāo)本 4.5 標(biāo)本量不足的標(biāo)本 4.6 未按標(biāo)本保存要求進(jìn)行送檢前保存的標(biāo)本 4.7 采集標(biāo)本時(shí)間距送檢時(shí)間過長而未達(dá)到要求的標(biāo)本

　五、 注意事項(xiàng) 5.1 標(biāo)本接收驗(yàn)收與拒收工作實(shí)際上是實(shí)驗(yàn)室對送檢驗(yàn)標(biāo)本外在質(zhì)量的把關(guān)，是做好檢測前質(zhì)量控制重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

　5.2 標(biāo)本接收驗(yàn)收情況要做好記錄，標(biāo)本不合格的情況要及時(shí)反饋給申請科室。如有標(biāo)本回退困難或標(biāo)本重新采集困難的情況時(shí)，應(yīng)與申請醫(yī)生直接聯(lián)系，告知標(biāo)本不合格情況，如臨床醫(yī)生仍要求對此標(biāo)本進(jìn)行檢測，應(yīng)告知此不合格標(biāo)本對檢測結(jié)果造成的影響，并在檢驗(yàn)報(bào)告做出相應(yīng)的文字說明，并對以上情況做好記錄。

　六、SOP 文件的更改 該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR01003 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　6

　第 6 頁 共 37 頁 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、 目的：擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)標(biāo)本經(jīng)驗(yàn)收合格后，需要經(jīng)過一系列的處理，才能進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)檢測。

　 本程序規(guī)范臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)前的處理。

　二、 范圍：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

　三、 標(biāo)本檢測前處理規(guī)程內(nèi)容 3.1

　DNA 擴(kuò)增檢測標(biāo)本（HBV-DNA）：

　3.1.1 血液標(biāo)本：標(biāo)本經(jīng)驗(yàn)收合格后，立即放入 37℃水浴箱溫育 10 分鐘，然后 3000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 5 分鐘，取血清 500ul，加入 1.5ml 滅菌離心管內(nèi)，于－20℃±5℃保存（不超過 3個(gè)月，如超過 3 個(gè)月，需－70℃保存）； 3.1.2 乳汁標(biāo)本：標(biāo)本經(jīng)驗(yàn)收合格后，立即 3000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 5 分鐘，取上清 500ul，加入 1.5ml 滅菌離心管內(nèi)，于－20℃±5℃保存（不超過 3 個(gè)月，如超過 3 個(gè)月，需－70℃保存）

　3.2

　RNA 擴(kuò)增檢測標(biāo)本：

　3.2.1 HCV-RNA 檢測標(biāo)本：標(biāo)本經(jīng)驗(yàn)收合格后，立即放入 37℃水浴箱溫育 10 分鐘，然后 3000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 5 分鐘，取血清 500ul，加入 1.5ml 滅菌離心管內(nèi)，于－20℃±5℃保存（不超過 3 個(gè)月，如超過 3 個(gè)月，需－70℃保存）； 3.2.2

　EV-71 RNA 檢測標(biāo)本：本檢測標(biāo)本類型為咽拭子。咽拭子標(biāo)本經(jīng)掃碼核收后，加入 1ml 生理鹽水，充分振蕩（振蕩儀振蕩 1 分鐘），取 500ul 溶液標(biāo)本，加入 1.5ml 滅菌離心管內(nèi)，于－20℃±5℃保存（不超過 3 個(gè)月，如超過 3 個(gè)月，需－70℃保存）

　3.3 上述離心標(biāo)本如在 2 小時(shí)內(nèi)檢測，則不需冷凍保存； 冷凍標(biāo)本檢測前需解凍復(fù)溶，可于 37℃水浴箱溫育 5 分鐘復(fù)溶，避免反復(fù)凍溶。

　四、SOP 文件的更改 該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR01004 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 耗材消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　7

　第 7 頁 共 37 頁 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 實(shí)驗(yàn)耗材消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、目的：規(guī)范臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)耗材消毒工作。

　二、 范圍：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

　三、實(shí)驗(yàn)耗材消毒內(nèi)容 3.1 消毒耗材詳單：1.5ml 離心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、擴(kuò)增反應(yīng)管（帶蓋）

　3.2 消毒前準(zhǔn)備：

　3.2.1 將離心管、反應(yīng)管分別裝于消毒盒內(nèi)

　3.2.2 將吸嘴按 10ul、200ul、1000ul 分別裝于吸嘴盒內(nèi) 3.3 消毒：高壓滅菌鍋 121℃，30 分鐘高壓滅菌 3.3.1 確保高壓滅菌鍋狀態(tài)正常，加水，確認(rèn)水位在水位刻度以上 3.3.2 將分裝好耗材的各消毒盒放于高壓滅菌鍋內(nèi)，依次擺好 3.3.3 插上電源插頭，打開放氣閥和安全閥閥門，待高壓滅菌鍋上氣后排氣 5 分鐘 3.3.4 關(guān)閉放氣閥和安全閥閥門，待氣壓指示針達(dá)到刻度 115 時(shí)開始計(jì)時(shí) 3.3.5 當(dāng)氣壓指示針達(dá)到 121 時(shí)，拔下電源插頭；當(dāng)氣壓指示針即將達(dá)到刻度 115 時(shí)插上

　電源插頭；如此循環(huán) 30 分鐘。

　3.4 消毒后處理：將高壓滅菌后的消毒盒、吸嘴盒放于烤箱內(nèi)烤干備用 3.5 備注：高壓滅菌鍋在微生物實(shí)驗(yàn)室。

　四、SOP 文件的更改 該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR01004 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 清潔消毒準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　8

　第 8 頁 共 37 頁 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室清潔消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、目的：規(guī)范臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室清潔消毒工作。

　二、 范圍：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

　三、清潔消毒內(nèi)容 3.1 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)開始前，整理實(shí)驗(yàn)室工作臺面，搞好實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生 3.2 對生物安全柜進(jìn)行紫外燈消毒一小時(shí)，同時(shí)用紫外燈對擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行消毒一小時(shí) 3.3 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)過程中按要求進(jìn)行操作，防止污染發(fā)生 3.4 生物安全柜內(nèi)操作結(jié)束后，立即進(jìn)行紫外燈消毒一小時(shí) 3.5 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，整理工作臺面，搞好實(shí)驗(yàn)衛(wèi)生 3.5.1

　做好生物安全柜的清潔工作：用 75%酒精（嚴(yán)禁用次氯酸鈉）對生物安全柜各表面進(jìn)行擦洗 3.5.2

　次氯酸鈉溶液擦工作臺面 3.5.3

　清潔擴(kuò)增儀表面 3.6

　對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行紫外燈消毒一小時(shí) 3.7

　開窗，做好實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)

　 四、SOP 文件的更改 該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR02001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 N SLAN 擴(kuò)增儀標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　9

　第 9 頁 共 37 頁 SLAN＠ 熒光定量 R PCR 擴(kuò)增儀標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、目的：規(guī)范 SLAN＠ 熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀的標(biāo)準(zhǔn)操作。

　二 、范圍：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 三、責(zé)任人要 求：經(jīng)過培訓(xùn)考核合格的臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作人員 四、儀器廠家：上海宏石醫(yī)療科技有限公司 五、檢測原理：

　SLAN ® 熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀集 PCR 擴(kuò)增（重復(fù)循環(huán) PCR 三個(gè)基本反應(yīng)步驟：變性-退火-延伸三過程，1～2 小時(shí)將待測目標(biāo)基因擴(kuò)增放大）、熒光檢測（在 PCR 反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針，激發(fā)的熒光信號值與所擴(kuò)增的目標(biāo)基因數(shù)量成正比，通過對試管內(nèi)熒光值的實(shí)時(shí)監(jiān)測，來實(shí)現(xiàn)模板的定量檢測）于一身，實(shí)時(shí)監(jiān)測每個(gè)試管內(nèi)熒光量的增長過程，在擴(kuò)增結(jié)束后，系統(tǒng)通過軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)自動進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示每個(gè)標(biāo)本的起始濃度等實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　六、 標(biāo)準(zhǔn)操作：

　6.1 開機(jī)前檢查：整理擴(kuò)增儀臺面，保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定、儀器表面清潔，電源穩(wěn)定 6.2 開機(jī)自檢：打開電源開關(guān)及 LIS 電腦，等待儀器自檢，自檢完成后，打開工作軟件。

　6.3 實(shí)驗(yàn)樣品上機(jī)：點(diǎn)擊“熱蓋”選項(xiàng)，等待擴(kuò)增儀自動熱蓋完成后，推開位于儀器上方的蓋子，即將蓋子按其軌道往后推。將實(shí)驗(yàn)樣品按次序放入加熱模塊，關(guān)閉儀器蓋子。

　6.4 擴(kuò)增檢測設(shè)置：

　6.4.1 文件設(shè)置：打開工作軟件，點(diǎn)擊左上方的“新建文件”按鈕，選擇新建一個(gè) PCR 文

　 件，點(diǎn)擊“確定”鍵，在彈出的對話框中選擇通道，點(diǎn)擊“確定”。

　6.4.2 板面設(shè)置：點(diǎn)擊“模板編輯”后，選中所放樣品位置對應(yīng)的孔，鼠標(biāo)點(diǎn)擊右鍵，

　 進(jìn)行樣品類型的選擇：

　6.4.2.1 已知標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)品，點(diǎn)擊“檢驗(yàn)項(xiàng)目”，在下拉菜單中選擇 HBV，在屬性一

　 欄輸入具體的濃度值，點(diǎn)擊“確定”保存；

　6.4.2.2 待測樣本設(shè)為樣品，點(diǎn)擊“檢驗(yàn)項(xiàng)目”，在下拉菜單中選擇 HBV，點(diǎn)擊“確定”

　 保存； 6.4.2.3 陽性對照，陰性對照及質(zhì)控品分別選擇相應(yīng)的選項(xiàng)，點(diǎn)擊“確定”保存 6.4.3 擴(kuò)增程序選擇：點(diǎn)擊“基因擴(kuò)增”，進(jìn)入基因擴(kuò)增版面，點(diǎn)擊屏幕右方的“打開”

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR02001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 N SLAN 擴(kuò)增儀標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　10

　第 10 頁 共 37 頁

　按鈕，選擇已經(jīng)設(shè)置好的程序名稱，打開即可。

　6.5 運(yùn)行：設(shè)置完成后，點(diǎn)擊“開始實(shí)驗(yàn)”按鈕，儀器會提示是否要開始，點(diǎn)擊“確定”。

　6.5 數(shù)據(jù)分析：

　 程序運(yùn)行結(jié)束（儀器提示：“正常運(yùn)行結(jié)束”）后，所有的數(shù)據(jù)儀器會自動給出。

　點(diǎn)擊“實(shí)驗(yàn)結(jié)果”按鈕，進(jìn)入分析界面，即可顯示所有反應(yīng)管的樣品名及濃度值。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果版面下的“模板模式”、“擴(kuò)增曲線”、“標(biāo)準(zhǔn)曲線”、“報(bào)告模式”下數(shù)據(jù)，綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告 6.6 關(guān)機(jī) 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行及分析完成后，點(diǎn)擊“工具”按鈕，在下拉菜單中點(diǎn)擊“打開熱蓋”，待儀器打開后，即可向后推開蓋子，取出已擴(kuò)增反應(yīng)管。關(guān)閉擴(kuò)增儀及 LIS 電腦，整理清潔擴(kuò)增儀臺面。

　七、 儀器保養(yǎng)與維護(hù)

　7.1 儀器清潔：每周一檢測結(jié)束后，關(guān)閉擴(kuò)增儀并拔掉電源線，用軟布沾清水擦洗（擦洗后一定要將儀器擦干），注意一定不能用化學(xué)劑用有機(jī)溶液清洗。用濕棉纖將縫隙中的灰塵清除。

　7.2 反應(yīng)孔清潔：反應(yīng)孔沾染灰塵或雜質(zhì)后，會影響 PCR 擴(kuò)增和熒光檢測。每三個(gè)月清潔一次反應(yīng)孔，即用吹氣球輕輕吹拭反應(yīng)孔。儀器不使用時(shí)必須關(guān)閉上蓋，并套上防塵罩。

　7.3 儀器保護(hù)：

　7.3.1 不能頻繁開關(guān)擴(kuò)增儀，兩次開關(guān)間隔時(shí)間必須超過 1 分鐘； 7.3.2 一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模塊往往還有較高溫度，不能立即關(guān)閉擴(kuò)增儀電源，應(yīng)讓風(fēng)扇繼續(xù)運(yùn)行三十分鐘后，當(dāng)模塊溫度下降至室溫時(shí)再關(guān)閉擴(kuò)增儀電源開關(guān)或進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。

　7.3.3 擴(kuò)增儀的控溫范圍為 4-99℃，禁止在擴(kuò)增儀上進(jìn)行沸水浴和低溫保溫操作。

　7.3.4 實(shí)驗(yàn)室工作人員禁拆卸擴(kuò)增儀。如有需要，請聯(lián)系廠家工程師進(jìn)行拆卸操作。

　7.3.5 更換保險(xiǎn)絲：擴(kuò)增儀裝有兩個(gè) 5.0A 保險(xiǎn)絲。當(dāng)保險(xiǎn)絲損壞后，工作人員應(yīng)知曉保險(xiǎn)絲的更換：切斷主機(jī)電源并拔掉電源線，用一字螺絲刀逆時(shí)針擰開機(jī)廂后方保險(xiǎn)絲盒蓋，更換保險(xiǎn)絲（保險(xiǎn)絲型號：Φ5×20mm-5A、250V），再蓋好保險(xiǎn)絲盒蓋，最后插上電源線。

　八、 附錄：

　8.1 儀器組成部分 ：

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR02001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 N SLAN 擴(kuò)增儀標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 11 頁 共 37 頁

　計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、控制部件、熱蓋部件、熱循環(huán)部件、光電檢測部件、傳動部件、電源部件等。

　8.2 主要結(jié)構(gòu)示意圖：

　8.3 儀器面板標(biāo)識：

　8.4 使用要求：

　電源 220V（±10%）

　、50Hz

　 操作環(huán)境溫度 10 ～ 30 ℃

　 功率 < 500VA

　操作環(huán)境相對濕度 20 ～ 80% 8.5 系統(tǒng)性能：

　樣品容量 48 孔 × 0.2ml

　 激發(fā)濾光片

　470nm、530nm、630nm（585nm）

　樣品容積 20 ～ 50µl

　 發(fā)射濾光片

　510nm、565nm、665nm（620nm）

　控溫范圍 4 ～ 99 ℃

　 靈敏度

　最小分辨率為 1 個(gè)拷貝

　重復(fù)性 CV< 1.5%

　 線性范圍 10 0 ～ 10 10 個(gè)拷貝 檢測探針或染料

　FAM、SYBR、HEX、JOE、VIC、TET、ROX、TEXRD、CY5 8.5 聯(lián)系方式：021-65107515 9 9 、P SOP 文件的更改

　該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

　 前面板指示燈：

　后面板：

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR02002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 12 頁 共 37 頁 生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、目的：規(guī)范生物安全柜的操作與維護(hù)保養(yǎng)工作，確保設(shè)備的正常運(yùn)作，以保障操作人員的安全。

　二 、范圍：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 三、責(zé)任人要求：經(jīng)過培訓(xùn)考核合格的臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作人員 四、儀器品牌型號：

　BIOBASE，BHC-1100IIA2（II 級 A2 型）

　五、儀器廠家：濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司 六、工作原理：

　生物安全柜的工作原理主要是將柜內(nèi)空氣向外抽吸，使柜內(nèi)保持負(fù)壓狀態(tài)，安全柜內(nèi)的氣體不能外泄從而保護(hù)工作人員；外界空氣經(jīng)高效空氣過濾器過濾后進(jìn)入安全柜內(nèi)，以避免處理樣品被污染；柜內(nèi)空氣也需經(jīng)過高效空氣過濾器過濾后再排放到大氣中以保護(hù)環(huán)境。

　II 級 A2 型生物安全柜：前窗操作口流入氣流最小平均流速為 0.5m/s；柜內(nèi) 70%氣體通過高效空氣過濾器過濾后再循環(huán)至工作區(qū)，30%氣體通過排氣口高效空氣過濾器過濾后排出； 安全柜內(nèi)的污染氣流經(jīng)過高效空氣過濾器過濾后經(jīng)過生物安全柜的外排接口通過排風(fēng)管排到大氣中。

　 七、標(biāo)準(zhǔn)操作：

　7.1 開機(jī)前先接通電源線，用鑰匙打開生物安全柜的開關(guān)，按下電源按鈕“Power supply”，電源指示燈亮 7.2 使用前，關(guān)閉前玻璃窗，按下進(jìn)風(fēng)開關(guān)按鈕“Wind-in motor”、排風(fēng)開關(guān)按鈕“Wind-out motor”和紫外燈消毒開關(guān)按鈕“Disinfect switch”,三個(gè)指示燈亮，消毒 30 分鐘。

　7.3 按下紫外燈消毒開關(guān)按鈕“Disinfect switch”，此燈滅，關(guān)閉紫外燈。按下照明燈開關(guān)按鈕“Light switch”,照明指示燈亮，照明燈亮。打開前玻璃窗口，高度不能超過 20 厘米（超過即安全柜發(fā)出報(bào)警音）。

　7.4 使用時(shí)，將實(shí)驗(yàn)相關(guān)物品依次擺放于生物安全柜內(nèi)，雙臂緩緩伸入安全柜內(nèi)，至少靜止2min，使柜內(nèi)氣流穩(wěn)定后再進(jìn)行操作；操作時(shí)保證操作人員的臉部在工作窗口之上。在柜內(nèi)操作時(shí)動作應(yīng)輕柔、舒緩，防止影響柜內(nèi)氣流。

　7.5 操作完成后，關(guān)閉玻璃視窗，保持進(jìn)風(fēng)與排風(fēng)繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，按下照明燈開關(guān)按鈕“Light switch”，關(guān)閉照明功能，關(guān)燈；同時(shí)按下紫外燈消毒開關(guān)按鈕“Disinfect switch”，打

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR02002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 13 頁 共 37 頁 開紫外燈，消毒 30min。

　7.6 消毒結(jié)束后，按下進(jìn)風(fēng)開關(guān)按鈕“Wind-in motor”、排風(fēng)開關(guān)按鈕“Wind-out motor”、紫外燈消毒開關(guān)按鈕“Disinfect switch”和電源按鈕“Power supply”，用鑰匙關(guān)閉電源，拔下電源線。

　7.7 附：生物安全拒操作面板示意圖

　7.7 維護(hù)與保養(yǎng) 7.7.1 每次操作后用 75%的酒精徹底對安全柜內(nèi)部工作區(qū)域表面、側(cè)壁、后壁、窗戶進(jìn)行表面凈化。切勿使用含有氯的殺菌劑，因?yàn)槠淇赡軐Π踩�柜的不銹鋼結(jié)構(gòu)造成損壞。同時(shí)對紫外燈和電源輸出口表面進(jìn)行清潔。當(dāng)清潔安全柜內(nèi)部區(qū)域時(shí)，操作人員除了手放以外，身體的其他任何部位不能進(jìn)入安全柜。

　7.7.2 每月用濕布對安全柜外部表面進(jìn)行擦拭，尤其是安全柜的前面和上部，把堆積的灰塵打掃干凈。并檢查所有的維護(hù)配件的合理使用情況。

　 7.7.3 紫外燈使用超過 2000 小時(shí)后進(jìn)行紫外燈的更換 7.7.4 每十八個(gè)月通知廠家更換高效空氣過濾器，并對生物安全柜進(jìn)行檢修與維護(hù)

　8 8 、P SOP 文件的更改

　該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

　進(jìn)風(fēng) 出風(fēng) 紫外燈 照明 電源

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HBV- -A DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 14 頁 共 37 頁 乙型肝炎病毒核酸定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序 一、 目的

　 規(guī)范乙型肝炎病毒核酸定量檢測的操作。定量檢測臨床血清或血漿樣本中的乙型肝炎（HBV）DNA，用于乙型肝炎的輔助診斷和抗病毒藥物的療效觀察。

　二、方法

　 PCR-熒光探針法 三、原理

　采用核酸釋放劑快速裂解、釋放血清或血漿中的 HBV-DNA，利用針對 HBV 核酸保守區(qū)設(shè)計(jì)的一對特異性引物、一條特異熒光探針，配以 PCR 反應(yīng)液，在熒光定量 PCR 儀上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測技術(shù)，通過熒光信號的變化實(shí)現(xiàn) HBV-PCR 的定量檢測。

　四、 標(biāo)本要求

　4.1 標(biāo)本類型

　血清或血漿、乳汁 4.2 標(biāo)本要求 4.2.1 血清標(biāo)本：無菌采血試管（紅蓋無添加物或黃蓋含促凝劑試管）靜脈采血 2.0ml。室溫放置不超過 4 小時(shí)，3000rpm 離心 5 分鐘分離血清，轉(zhuǎn)移至 1.5ml 滅菌離心管中備用 4.2.2 血漿標(biāo)本：EDTA 或枸櫞酸鈉抗凝無菌試管靜脈采血 2.0ml，混勻。室溫放置不超過 4小時(shí)，3000rpm 離心 5 分鐘分離血清，轉(zhuǎn)移至 1.5ml 滅菌離心管中備用 4.2.3 乳汁標(biāo)本：無菌試管采集乳汁 2.0ml。室溫放置不超過 4 小時(shí)，3000rpm 離心 5 分鐘分離上清，轉(zhuǎn)移至 1.5ml 滅菌離心管中備用 4.2.4

　如標(biāo)本不能當(dāng)晶檢測，則需將轉(zhuǎn)移至 1.5ml 滅菌管標(biāo)本放于-20℃冷凍冰箱內(nèi)保存，檢測前再復(fù)融，標(biāo)本嚴(yán)禁反復(fù)凍融 五、儀器

　 上海宏石醫(yī)療科技有限公司 SLAN@ 熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀 六、試劑

　 湖南圣湘生物科技有限公司乙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒

　七、操作程序步驟

　1 7.1 試驗(yàn)前試劑準(zhǔn)備：

　7.1.1 取出包裝盒中的各組分，室溫放置 30 分鐘，待其溫度平衡至室溫后，混勻備用。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HBV- -A DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 15 頁 共 37 頁 7.1.2 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照以及定量參考品 A~D 數(shù)量，按比例（反應(yīng)液 38ul/人份+酶混合液 2ul/人份）取相應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液，充分混勻成 PCR-mix，瞬時(shí)離心后備用。

　7.2

　樣本處理：

　7.2.1 打開電腦 LIS 系統(tǒng)，登錄“免疫組（南院）”選擇儀器“PCR_南院”，選擇當(dāng)天日期，對標(biāo)本進(jìn)行編號，同時(shí)對應(yīng)標(biāo)本號標(biāo)本掃條碼或手工輸入病人標(biāo)本信息。

　7.2.2 按標(biāo)本要求對標(biāo)本進(jìn)行離心分離上清等處理；將陰性對照、陽性對照以及定量參考品A～D 進(jìn)行瞬時(shí)離心，使其溶液沉降至管底。

　7.2.3 選擇相應(yīng)數(shù)量 PCR 反應(yīng)管，每個(gè) PCR 反應(yīng)管中加入核酸釋放劑 5ul（深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡），然后分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照以及定量參考品 A～D 各 5ul，吸打 5 次混勻（輕輕吸打，避免出現(xiàn)氣泡）。

　7.2.4 放置 10 分鐘以，每管加入 PCR-mix40ul，蓋上管蓋（可用手指彈擊，去除氣泡）。

　R 7.3

　PCR 擴(kuò)增

　7.3.1 做好擴(kuò)增儀檢測前維護(hù)，打開擴(kuò)增儀開關(guān)。

　7.3.2 雙擊 SLAN 8.0 圖標(biāo)，運(yùn)行擴(kuò)增儀軟件 7.3.3 菜單新建實(shí)驗(yàn)文件，選擇熒光檢測通道：“通道 1：FAM,SYBR” 7.3.4 點(diǎn)擊熱蓋按鈕，熱蓋完成后，打開擴(kuò)增儀上蓋，將 PCR 反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，關(guān)閉上蓋。

　7.3.5 編輯擴(kuò)增模板：按樣本槽內(nèi)標(biāo)本編號順序設(shè)置樣本、陰性對照、陽性對照、定量參考品，參考品屬性欄內(nèi)填入對應(yīng)參考品濃度。

　7.3.6 基因擴(kuò)增：打開擴(kuò)增程序，選擇 HBV-DNA 擴(kuò)增程序文件：“SX-HBV.prg”，然后點(diǎn)擊“開始實(shí)驗(yàn)” 4 7.4 循環(huán)參數(shù)設(shè)定

　步

　驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù) 1 UNG 酶反應(yīng) 50℃ 2 分鐘 1 2 Taq 酶活化 94℃ 5 分鐘 1 3 變性 94℃ 15 秒 45 退火，延伸，及熒光采集 57℃ 30 秒 4 儀器冷卻 25℃ 10 秒 1 7.5 結(jié)果分析

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HBV- -A DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 16 頁 共 37 頁

　 反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果模塊下，結(jié)合模板模式、擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線及報(bào)告模式中數(shù)據(jù)及各曲線，分析反應(yīng)結(jié)果：

　7.5.1 HBV 陰性對照：無 Ct 值顯示，定量結(jié)果<250。

　7.5.2 HBV 陽性對照：檢測濃度值介于 1.26×105 ～1.26×10 6 IU/ml。

　7.5.3 四個(gè) HBV 定量參考品：均檢測為陽性，定量濃度值與給定值相符，且標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù) R2 ≥0.98。

　7.5.4 以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。

　S 7.6

　LIS 報(bào)告

　7.6.1 數(shù)據(jù)導(dǎo)出：菜單選擇“導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果”，文件名設(shè)為“1”，保存結(jié)果 7.6.2

　LIS 傳輸：桌面雙擊“LISMontor.exe”程序，打開 LIS 傳輸程序，點(diǎn)擊“Getlnfo”按鈕，數(shù)據(jù)傳輸至 LIS 系統(tǒng)中對應(yīng)的標(biāo)本號結(jié)果中 7.6.3 分析每一個(gè)病人結(jié)果，回顧近三個(gè)月的歷史檢測數(shù)據(jù)及相關(guān)檢測數(shù)據(jù)，核準(zhǔn)結(jié)果，發(fā)出檢測報(bào)告。

　7.7 關(guān)機(jī)

　7.7.1

　熱蓋后打開擴(kuò)增儀上蓋，取出當(dāng)晶檢測樣本，關(guān)閉擴(kuò)增儀軟件，LIS 軟件，關(guān)閉擴(kuò)增儀電源開關(guān)，關(guān)閉電腦 7.7.2 整理擴(kuò)增儀、電腦工作臺面，清潔擴(kuò)增儀，做好檢測后儀器維護(hù) 八、 參考值及檢測限

　試劑盒給出檢測下限為 1.0×102 IU/ml，內(nèi)標(biāo) Ct 的參考值為 40。本實(shí)驗(yàn)室報(bào)告下限為<250。

　九、結(jié)果解釋

　9.1 對于測定值在 5.0×102 ～5.0×10 9 IU/ml 之間的樣本，且擴(kuò)增曲線成明顯 S 型，報(bào)告相應(yīng)的測定結(jié)果。

　9.2 對于測定值>5.0×109 IU/ml 的樣本，且擴(kuò)增曲線成明顯 S 型，報(bào)告注明>5.0×10 9 IU/ml。若需精確定量可根據(jù)結(jié)果，將樣本稀釋至 5.0×109 IU/ml 以下再復(fù)測。

　9.3 對于測定值≥2.5×102 IU/ml 而<5.0×10 2 IU/ml 的樣本，且擴(kuò)增曲線成明顯 S 型，表明病毒載量低，可直接報(bào)告測定值，但注明：所測定量結(jié)果僅供參考。

　9.4 對于測定值<2.5×102 IU/ml 的樣本，則報(bào)告 HBV-DNA 含量低于報(bào)告下限為<250 十、 備注

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HBV- -A DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　17

　第 17 頁 共 37 頁

　如在檢測工作中出現(xiàn)異常情況，需聯(lián)系儀器及試劑廠家

　上海宏石醫(yī)療科技有限公司：021-65107515

　湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗(yàn)科 R PCR 實(shí)驗(yàn)室

　作業(yè)指導(dǎo)書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 EV71- -A RNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

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　第 18 頁 共 37 頁 腸道病毒 1 71 型核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、 目的

　規(guī)范腸道病毒 71 型核酸定量檢測（PCR-熒光探針法）的操作。定量檢測咽拭子樣本中的腸道病毒 71 型（EV-71）核酸，用于 EV71 感染的輔助診斷。

　二、方法

　 PCR-熒光探針法 三、原理

　針對 EV71 核酸保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和特異性熒光探針，配以 RT-PCR 反應(yīng)液，在熒光定量 PCR 儀上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測技術(shù)，通過熒光信號的變化實(shí)現(xiàn) EV71-RNA 的定量檢測。

　四、標(biāo)本要求

　4.1 標(biāo)本類型

　咽拭子 4.2 標(biāo)本要求 4.2.1

　標(biāo)本處理相關(guān)耗材要求：1.5ml 離心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、擴(kuò)增反應(yīng)管（帶蓋）均需高壓滅菌（121℃，30 分鐘)處理 4.2.2 標(biāo)本要求：咽拭子標(biāo)本采樣后，加 2ml 生理鹽水，振蕩器振蕩 1 分鐘混勻，1 小時(shí)內(nèi)檢測。如果 1 小時(shí)內(nèi)無法檢測，則需放于-20℃冷凍箱保存，檢測時(shí)復(fù)融（只能復(fù)溶一次，嚴(yán)禁反復(fù)凍融）。

　五、儀器

　 上海宏石醫(yī)療科技有限公司 SLAN@ 熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀 六、試劑

　 湖南圣湘生物科技有限公司腸道病毒 71 型（EV71）定量測定試劑盒

　七、操作程序步驟

　1 7.1 試驗(yàn)前試劑準(zhǔn)備：

　7.1.1 取出包裝盒中的各組分，室溫放置 30 分鐘，待其溫度平衡至室溫后，混勻離心備用。

　7.1.2 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照數(shù)量，按比例（RNA 提取液 1 600ul/人份+EV71內(nèi)標(biāo) 1ul/人份）取相應(yīng)量的 RNA 提取溶液 1 及 EV71 內(nèi)標(biāo)，充分混勻成提取試劑 1-mix，瞬時(shí)離心后備用。

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　生效日期：20151010

　19

　第 19 頁 共 37 頁 7.1.3 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照數(shù)量，按比例（PCR 反應(yīng)液 43ul/人份+EV71 酶混合液 2ul/人份）取相應(yīng)量的 EV71 PCR 反應(yīng)液及酶混合液，充分混勻 PCR-mix，瞬時(shí)離心后備用。

　7.2 樣本處理：

　7.2.1

　打開電腦 LIS 系統(tǒng)，登錄“免疫組（南院）”選擇儀器“PCR_南院”，選擇當(dāng)天日期，對標(biāo)本進(jìn)行編號，同時(shí)對應(yīng)標(biāo)本號標(biāo)本掃條碼或手工輸入病人標(biāo)本信息。

　7.2.2 取適量 1.5ml 滅菌離心管，分別標(biāo)記樣本編號，陰性對照、陽性對照。每管加入 200ul待測標(biāo)本及陰、陽性對照，600ul RNA 提取液 1-mix，然后再加入 100ul RNA 提取液 2，震蕩10 秒充分混勻。

　7.2.3 將離心管放入加熱器，58℃放置 10 分鐘，然后置于 2-8℃冰箱內(nèi)放置 10 分鐘 7.2.4 將離心管瞬時(shí)離心（即達(dá)到 1000rpm 時(shí)立即停止離心），將離心管置于磁珠分離器上3 分鐘（離心管開品面向操作者）

　7.2.5 在磁珠分離器上將離心管內(nèi)溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質(zhì)）

　7.2.6 每管加入 600ul RNA 提取液 3，然后再加入 200ul RNA 提取液 4，震蕩 10 秒充分混勻 7.2.7 將離心管瞬時(shí)離心，將離心管置于磁珠分離器上 3 分鐘 7.2.8 在磁珠分離器上將離心管內(nèi)溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質(zhì)），靜置 1 分鐘后將管底殘留余液再次吸出丟棄 7.2.9 每個(gè)離心管加入 30ul RNA 洗脫液，將離心管壁上的磁珠充分洗脫到管底，吸打混勻 5次，室溫靜置 10 分鐘，然后將離心管再次放置于磁珠分離器上 3 分鐘。

　7.2.10 根據(jù)樣本、陰、陽性對照數(shù)量選擇相應(yīng)數(shù)量的 PCR 反應(yīng)管，每個(gè)反應(yīng)管加入 45ul PCR-mix 7.2.11 每個(gè) PCR 反應(yīng)管內(nèi)再加入磁珠分離器上離心管內(nèi)洗脫下的 RNA 混合液（注意不能磁到離心管壁上的磁珠）5ul，最后將 PCR 反應(yīng)管加蓋 R 7.3 PCR 擴(kuò)增

　7.3.1 做好擴(kuò)增儀檢測前維護(hù)，打開擴(kuò)增儀開關(guān) 7.3.2 雙擊 SLAN 8.0 圖標(biāo)，運(yùn)行擴(kuò)增儀軟件 7.3.3 菜單新建實(shí)驗(yàn)文件，選擇熒光檢測通道：“通道 1：FAM,SYBR”和“通道 2：HEX,VIC,JOE,TET”

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　20

　第 20 頁 共 37 頁 7.3.4 點(diǎn)擊熱蓋按鈕，熱蓋完成后，打開擴(kuò)增儀上蓋，將 PCR 反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，關(guān)閉上蓋。

　7.3.6 編輯擴(kuò)增模板：按樣本槽內(nèi)標(biāo)本編號順序設(shè)置樣本、陰性對照、陽性對照、。

　7.3.7 基因擴(kuò)增：打開擴(kuò)增程序，選擇 EV71-RNA 擴(kuò)增程序文件：“SX-EV71.prg”，然后點(diǎn)擊“開始實(shí)驗(yàn)” 4 7.4 循環(huán)參數(shù)設(shè)定

　步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù) 1 預(yù)變性和酶激活 95℃ 1 分鐘 1 2 逆轉(zhuǎn)錄 50℃ 30 分鐘 1 3 cDNA 預(yù)變性 95℃ 1 分鐘 1 4 變性 95℃ 15 秒 45 退火，延伸，及熒光采集 30℃ 30 秒 5 儀器冷卻 25℃ 10 秒 1 7.5 結(jié)果分析

　反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果模塊下，結(jié)合模板模式、擴(kuò)增曲線及報(bào)告模式中數(shù)據(jù)及各曲線，分析反應(yīng)結(jié)果：

　7.5.1 EV71 陰性對照：無 Ct 值顯示，但內(nèi)標(biāo)檢測為陽性，且 Ct 值<37.5。

　7.5.2 EV71 陽性對照：檢測 Ct 值<37.5,內(nèi)標(biāo)檢測為陽性，且 Ct 值<37.5。

　7.5.3 每一個(gè)檢測樣本的內(nèi)標(biāo)檢測為陽性，且 Ct 值<37.5 以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。

　S 7.6 LIS 報(bào)告

　7.6.1 記錄每一個(gè)陽性檢測樣本的 Ct 值，手工輸入 LIS 系統(tǒng)中，陰性檢測樣本，LIS 系統(tǒng)默認(rèn)為 Ct 值<37.5 7.6.2 核對每一個(gè)結(jié)果，注意 LIS 系統(tǒng)中是否有歷史結(jié)果，回顧性分析檢測結(jié)果，核準(zhǔn)所有結(jié)果，發(fā)出報(bào)告 7.7 關(guān)機(jī)

　7.7.1

　熱蓋后打開擴(kuò)增儀上蓋，取出當(dāng)晶檢測樣本，關(guān)閉擴(kuò)增儀軟件，LIS 軟件，關(guān)閉擴(kuò)增儀電源開關(guān)，關(guān)閉電腦

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　21

　第 21 頁 共 37 頁 7.7.2 整理擴(kuò)增儀、電腦工作臺面，清潔擴(kuò)增儀，做好檢測后儀器維護(hù) 八、參考值

　試劑盒給出 EV71 的 Ct 值為 36，檢測內(nèi)標(biāo) Ct 的參考值為 36.本實(shí)驗(yàn)室所定的參考值為:Ct值<37.5 九、結(jié)果解釋

　9.1 對于測定 Ct 值<37.5 樣本報(bào)告為 EV71-RNA 陽性。

　9.2 對于測定 Ct 值>37.5 或無 Ct 值的樣本，同時(shí)內(nèi)標(biāo)檢測為陽性，且 Ct 值<37.5，則報(bào)告為EV71-RNA 陰性 9.3 當(dāng)檢測樣本中內(nèi)標(biāo)檢測 Ct 值>37.5 時(shí)，則該樣本檢測結(jié)果無效，需查找并排除原因，并對此樣本進(jìn)行復(fù)檢（如復(fù)檢仍無效，則需與試劑廠家聯(lián)系，并保存好當(dāng)日標(biāo)本）

　十一、 備注

　如在檢測工作中出現(xiàn)異常情況，需聯(lián)系儀器及試劑廠家 上海宏石醫(yī)療科技有限公司：021-65107515 湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

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　第 22 頁 共 37 頁

　丙型肝炎病毒 A RNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、目的

　規(guī)范丙型肝炎病毒 RNA 定量檢測（PCR-熒光探針法）的操作。定量檢測臨床血清或血漿樣本中的丙型肝炎病毒（HCV）RNA，用于丙型肝炎的輔助診斷。

　二、方法

　 PCR-熒光探針法 三、原理

　采用磁珠法提取樣品中的丙型肝炎病毒 RNA，利用針對丙型肝炎病毒核酸保守區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物和熒炮控針，配以 PCR 反應(yīng)液，在熒光定量 PCR 儀上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測技術(shù)，通過熒光信號的變化實(shí)現(xiàn)丙型肝炎病毒 RNA 的定量檢測。

　四、標(biāo)本要求

　4.1 標(biāo)本類型

　血清或血漿樣本 4.2 標(biāo)本要求 4.2.1

　標(biāo)本處理相關(guān)耗材要求：1.5ml 離心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、擴(kuò)增反應(yīng)管（帶蓋）均需高壓滅菌（121℃，30 分鐘)處理 4.2.2 標(biāo)本要求：樣本采集后應(yīng)盡快離心樣本進(jìn)行檢測，室溫下不超過 4 小時(shí)。如果不能即時(shí)檢測，需將離心后樣本轉(zhuǎn)移至滅菌離心管內(nèi)置于-20℃±5℃冰箱內(nèi)保存，30 天內(nèi)檢測完畢。

　五、儀器

　 上海宏石醫(yī)療科技有限公司 SLAN@ 熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀 六、試劑

　 湖南圣湘生物科技有限公司腸道病毒丙型肝炎病毒 RNA 定量測定試劑盒

　七、操作程序步驟

　1 7.1 試驗(yàn)前試劑準(zhǔn)備：

　7.1.1 取出包裝盒中的各組分，室溫放置 30 分鐘，待其溫度平衡至室溫后，混勻離心備用。

　7.1.2 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照及參考品數(shù)量，按比例（RNA 提取液 1 600ul/人份丙型肝炎病毒內(nèi)標(biāo) 0.4ul/人份）取相應(yīng)量的 RNA 提取溶液 1 及丙型肝炎病毒內(nèi)標(biāo)，充分混勻成提取試劑 1-mix，瞬時(shí)離心后備用。

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　 23 第 23 頁 共 37 頁 7.1.3 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照及參考品數(shù)量，按比例（PCR 反應(yīng)液 49ul/人份+增強(qiáng)劑 1ul/人份）取相應(yīng)量的丙型肝炎病毒 PCR 反應(yīng)液及 RT-PCR 增強(qiáng)劑，充分混勻 PCR 混合液，瞬時(shí)離心后備用。

　7.2 樣本處理：

　7.2.1

　打開電腦 LIS 系統(tǒng)，登錄“免疫組（南院）”選擇儀器“PCR_南院”，選擇當(dāng)天日期，對標(biāo)本進(jìn)行編號，同時(shí)對應(yīng)標(biāo)本號標(biāo)本掃條碼或手工輸入病人標(biāo)本信息。

　7.2.2 取適量 1.5ml 滅菌離心管，分別標(biāo)記樣本編號，陰性對照、陽性對照及參考品。每管加入 200ul 待測標(biāo)本及陰、陽性對照及參考品，600ul RNA 提取液 1-mix，然后再加入 100ul RNA 提取液 2，震蕩 10 秒充分混勻后室溫靜置 30 分鐘。

　7.2.3

　將離心管瞬時(shí)離心（即達(dá)到 1000rpm 時(shí)立即停止離心），將離心管置于磁珠分離器上3 分鐘（離心管開品面向操作者）

　7.2.4 在磁珠分離器上將離心管內(nèi)溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質(zhì)）

　7.2.5 每管加入 600ul RNA 提取液 3，然后再加入 200ul RNA 提取液 4，震蕩 10 秒充分混勻 7.2.6 將離心管瞬時(shí)離心，將離心管置于磁珠分離器上 3 分鐘 7.2.7 在磁珠分離器上將離心管內(nèi)溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質(zhì)），靜置 1 分鐘后將管底殘留余液再次吸出丟棄 7.2.8 每個(gè)離心管加入 50ul PCR 混合液，將離心管壁上的磁珠充分洗脫到管底，吸打混勻。蓋上管蓋，上機(jī)檢測 R 7.3 PCR 擴(kuò)增

　7.3.1 做好擴(kuò)增儀檢測前維護(hù)，打開擴(kuò)增儀開關(guān) 7.3.2 雙擊 SLAN 8.0 圖標(biāo)，運(yùn)行擴(kuò)增儀軟件 7.3.3 菜單新建實(shí)驗(yàn)文件，選擇熒光檢測通道：“通道 1：FAM,SYBR” 7.3.4 點(diǎn)擊熱蓋按鈕，熱蓋完成后，打開擴(kuò)增儀上蓋，將 PCR 反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，關(guān)閉上蓋。

　7.3.6 編輯擴(kuò)增模板：按樣本槽內(nèi)標(biāo)本編號順序設(shè)置樣本、陰性對照、陽性對照、參考品及其屬性（即參考品濃度）。

　7.3.7 基因擴(kuò)增：打開擴(kuò)增程序，選擇丙型肝炎病毒 RNA 擴(kuò)增程序文件：“SX-HCV.prg”，

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　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HCV- -A RNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　 24 第 24 頁 共 37 頁 然后點(diǎn)擊“開始實(shí)驗(yàn)” 4 7.4 循環(huán)參數(shù)設(shè)定

　步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù) 1 預(yù)變性和酶激活 95℃ 1 分鐘 1 2 逆轉(zhuǎn)錄 60℃ 30 分鐘 1 3 cDNA 預(yù)變性 95℃ 1 分鐘 1 4 變性 95℃ 15 秒 45 退火，延伸，及熒光采集 30℃ 30 秒 5 儀器冷卻 25℃ 10 秒 1 7.5 結(jié)果分析

　反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果模塊下，結(jié)合模板模式、擴(kuò)增曲線及報(bào)告模式中數(shù)據(jù)及各曲線，分析反應(yīng)結(jié)果：

　7.5.1 HCV 陰性對照：無 Ct 值顯示，但內(nèi)標(biāo)檢測為陽性，且 Ct 值<38。

　7.5.2 HCV 陽性對照：檢測濃度值范圍為：1.58E+02-1.58E+03IU/mL。

　7.5.3 每一個(gè)檢測樣本的內(nèi)標(biāo)檢測為陽性，且 Ct 值<38 以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。

　S 7.6 LIS 報(bào)告

　7.6.1 記錄每一個(gè)陽性檢測樣本的 Ct 值，手工輸入 LIS 系統(tǒng)中，陰性檢測樣本，LIS 系統(tǒng)默認(rèn)為檢測結(jié)果低于檢測下限，即<25. 7.6.2 核對每一個(gè)結(jié)果，注意 LIS 系統(tǒng)中是否有歷史結(jié)果，回顧性分析檢測結(jié)果，核準(zhǔn)所有結(jié)果，發(fā)出報(bào)告 7.7 關(guān)機(jī)

　7.7.1

　熱蓋后打開擴(kuò)增儀上蓋，取出當(dāng)晶檢測樣本，關(guān)閉擴(kuò)增儀軟件，LIS 軟件，關(guān)閉擴(kuò)增儀電源開關(guān)，關(guān)閉電腦 7.7.2 整理擴(kuò)增儀、電腦工作臺面，清潔擴(kuò)增儀，做好檢測后儀器維護(hù) 八、參考值

　試劑盒給出檢測下限為 25IU/mL，內(nèi)標(biāo) Ct 參考值為≤38

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　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HCV- -A RNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

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　 25 第 25 頁 共 37 頁 九、結(jié)果解釋

　9.1 對于測定值在 5.0×102 ～1.0×10 8 IU/ml 之間的樣本，且擴(kuò)增曲線成明顯 S 型，報(bào)告相應(yīng)的測定結(jié)果。

　9.2 對于測定值>1.0×108 IU/ml 的樣本，且擴(kuò)增曲線成明顯 S 型，報(bào)告注明>1.0×10 8 IU/ml。若需精確定量可根據(jù)結(jié)果，將樣本稀釋至 1.0×108 IU/ml 以下再復(fù)測。

　9.3 對于測定值≥2.5×102 IU/ml 而<5.0×10 1 IU/ml 的樣本，且擴(kuò)增曲線成明顯 S 型，表明病毒載量低，可直接報(bào)告測定值，但注明：所測定量結(jié)果僅供參考。

　9.4 對于測定值<2.5×102 IU/ml 的樣本，則報(bào)告 HCV-DNA 含量低于報(bào)告下限為<25. 十二、 備注

　如在檢測工作中出現(xiàn)異常情況，需聯(lián)系儀器及試劑廠家 上海宏石醫(yī)療科技有限公司：021-65107515 湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　該標(biāo)準(zhǔn)操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報(bào)請專業(yè)主管進(jìn)行修改，科主任審核簽字后生效。

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　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HPV- -A DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　生效日期：20151010

　26

　第 26 頁 共 37 頁

　高危型 人乳頭狀瘤病毒（ HPV ）核酸檢測

　 1 目的：

　規(guī)范臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室對臨床標(biāo)本的處理，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率。

　2 適用范圍：

　14 種高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）核酸檢測試劑盒。

　3 職責(zé)：

　由臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室專業(yè)技術(shù)人員制定程序文件，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人審核，檢驗(yàn)所總負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)實(shí)施。

　4 檢測原理：

　本試劑盒基于采用 Taqman 熒光探針結(jié)合多重?zé)晒?PCR 技術(shù)，通過實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀，進(jìn)行同步核酸擴(kuò)增與檢測�？稍谕�一反應(yīng)管中通過儀器四種熒光檢測通道分別檢測 12 種高危型 HPV（31， 33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59， 66， 68），HPV16、HPV18及細(xì)胞內(nèi)對照 β-globin DNA。細(xì)胞內(nèi)對照 DNA 用于評估樣本質(zhì)量及 PCR 抑制因素。

　5 適用標(biāo)本類型：

　本試劑盒適用于男性泌尿生殖道分泌物或者女性尿道分泌物的棉拭子、女性宮頸脫落細(xì)胞樣本以及男女性疣體的樣本。

　6 標(biāo)準(zhǔn)操作程序：

　6.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備 6.1.1 從-20℃保存的試劑盒中取出 PCR MIX，4℃避光下平緩解凍，上下顛倒混勻后，點(diǎn)動離心；將-20℃保存的 Taq 酶管取出必須點(diǎn)動離心。

　6.1.2 建議對 48 人份/盒擴(kuò)增檢測試劑進(jìn)行一次性分裝。將 Taq 酶全部加入到 PCR MIX 中去，并再吸取 PCR MIX 到 Taq 酶管里潤洗 2 遍，保證 Taq 酶盡可能多的加到 PCR MIX 中。充分震蕩混勻 PCR MIX，在微型離心機(jī)上點(diǎn)動離心備用。

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　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內(nèi)容 HPV- -A DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

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　27

　第 27 頁 共 37 頁

　6.1.3 取出 48 人份 PCR 八聯(lián)管或者單管，在 PCR 管架上進(jìn)行排列，將移液器調(diào)至 18ul 后將混合好的 PCR 反應(yīng)液分裝到 0.2ml PCR 管中。取出當(dāng)天需要的實(shí)驗(yàn)的數(shù)量，通過傳遞窗傳送到標(biāo)本制備區(qū)，放于 4℃冰箱備用，其余的放入-20℃的試劑準(zhǔn)備區(qū)的冰箱保存?zhèn)溆茫ㄔ噭┍M量避光，勿多次反復(fù)凍融）。

　注：如需要每次單獨(dú)分裝的，可參照以下附表計(jì)算使用量，但需要在計(jì)算后的基礎(chǔ)上增加 1%—2%的消耗量。

　PCR-Mix DNA Taq 1 人份用量 17.5μl 0.5 μl 10 人份用量 175 μl 5 μl 20 人份用量 350 μl 10 μl 48 人份用量 840 μl 24μl 6.2 宮頸脫落細(xì)胞 DNA 的提�。�

　6.2.1 將臨床樣本震蕩混勻，伸入采集管底部吸取臨床樣本 0.5ml-1ml 至 1.5ml 的離心管中。（如果細(xì)胞數(shù)量少可以加大體積到 2ml。）

　6.2.2 14000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 1 分鐘（此 1 分鐘應(yīng)為有效的離心時(shí)間，若升降速率較慢的離心機(jī)應(yīng)相應(yīng)增加離心時(shí)間），棄上清（可保留殘液約 20μl）。

　6.2.2.1 對于血較多的臨床標(biāo)本，取細(xì)胞前在震蕩器上震蕩時(shí)間長些，離心收集細(xì)胞后，再用生理鹽水多洗一次。

　6.2.2.2 對于黏液過多的臨床標(biāo)本，去細(xì)胞前在震蕩器上震蕩的時(shí)間長些，不要取黏液，將取樣刷頭取出，吸取瓶底部液體。另要求醫(yī)生在取樣時(shí)盡量規(guī)范，先用棉簽把黏液擦去再進(jìn)行取樣。

　6.2.3 加入 0.5ml 細(xì)胞保存液振蕩重懸細(xì)胞，14000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 1 分鐘（此 1 分鐘應(yīng)為有效的離心時(shí)間，若升降速率較慢的離心機(jī)應(yīng)相應(yīng)增加離心時(shí)間），盡量去盡全部上清。

　6.2.4 每樣本加入 50ul 細(xì)胞裂解液，充分震蕩重懸細(xì)胞，煮沸 10 分鐘。

　6.2.5 14000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 10 分鐘，取上清（上清中為...

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